专利名称：抗绿脓杆菌Fab’片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫球蛋白，具体涉及一种免疫球蛋白的Fab'片段。
背景技术：
绿脓杆菌是假单胞菌属中最为多见的一种条件致病菌，广泛分布于自然 界中，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染和医源性感染等途径传播。绿脓 杆菌对外界抵抗力较其他细菌强，在潮湿处能长期生存，对干燥抵抗力强，营养 要求低，因其多重耐药性等特征，目前已成为医院内感染的主要致病菌。绿脓杆 菌感染与烧伤、免疫功能低下、败血症、下呼吸道感染等的关系极为密切，病死 率极高。虽然针对绿脓杆菌感染采用的抗生素不断更新，但由于绿脓杆菌具有广 谱耐药性，治疗效果往往不佳，使得寻找抗生素替代疗法成为迫切需要。
Fab'片段具有成本低、产量高、易制备、均一性及稳定性好、特异性强等独 特的优点，同时疗效可靠、价格适宜。目前已成功提取出抗小分子蛋白质、抗病 毒的Fab'，并发现其具有良好的生物学效应，用于口服防治肠道病原体已取得 良好效果。随着细菌耐药现象的逐渐加重，寻求一种既能抗菌又能够规避细菌耐 药的新型抗菌治疗途径已经成为研究的热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗绿脓杆菌的Fab'片段。 本发明解决上述技术问题的技术方案是
抗绿脓杆菌Fab'片段，其特征在于(1)所述抗绿脓杆菌Fab'片段能特异 性结合绿脓杆菌；(2)所述抗绿脓杆菌Fab'片段是通过以下方法获得的用绿 脓杆菌作为抗原免疫产蛋鸡后收集所产的蛋，然后从其卵黄中分离水溶部分，并 用硫酸钠沉淀，取沉淀物，最后用胃蛋白酶水解沉淀物，收集分子量为44KDa的 水解产物。本发明所述的抗绿脓杆菌Fab'片段是从用绿脓杆菌作为抗原免疫的产蛋鸡 的鸡蛋中提取得到的，具体方法是
(1) 用绿脓杆菌作为抗原免疫的产蛋鸡，取其蛋，分离出蛋黄液；
(2) 加入蛋黄液9倍体积的水溶解蛋黄液，调节pH5.0、 4t:放置6小时；
(3) 4。C下10000转/分离心25min，取上清液；(4)加入18%硫酸钠，溶解， 室温放置lh;
(5) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；
(6) 以与步骤(2)所用与蛋黄液等体积的0.01M、 pH7.4的PBS溶解沉淀， 加入14%硫酸钠，溶解，室温放置lh;
(7) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；
(8) 按步骤(7)所得沉淀质量的20倍加入胃蛋白酶，并用水溶解，调节溶 液pH3.5，加入适量甲苯，30。C水浴反应1.5h;
(9) 加入15%硫酸铵后调节pH5.0、 57t加热30min，然后迅速降温至45 。C以下；
(10) 4。C下10000转/分离心15min，取上清液；
(11) 调节上清液pH7.2，加入20%硫酸铵，4。C下8000转/分离心15min， 取沉淀；
(12) 用去离子水溶解沉淀，加明矾至明矾在溶液中的浓度为0.8 lg/100ml，调节pH7.8， 4。C下8000转/分离心15min，取上清液；
(13) 加入38%硫酸铵，4"C下8000转/分离心15min，取沉淀透析过滤除菌，
即可；
上述方法中的物质百分比浓度均为质量/体积百分比(W/V)。 本发明抗绿脓杆菌Fab'片段具有产量高、效价好、理化性质稳定、特异性
强等优点，并通过相关的体外实验证明本发明抗绿脓杆菌Fab'显著拮抗绿脓杆
菌的生长，可用于制备治疗绿脓杆菌感染的药物。
图1是本发明抗绿脓杆菌Fab'片段抗绿脓杆菌效价检测曲线。 图2是本发明抗绿脓杆菌Fab'片段免疫印迹结果图。
图3是绿脓杆菌在本发明抗绿脓杆菌Fab'片段作用下的生长曲线，其中曲 线令为正常生长的绿脓杆菌的生长曲线，曲线B是绿脓杆菌在5mg/ml本发明抗 绿脓杆菌Fab，片段作用下的生长曲线，曲线A是绿脓杆菌在10mg/ml本发明抗 绿脓杆菌Fab'片段作用下的生长曲线，曲线國是绿脓杆菌在20mg/ml本发明抗
绿脓杆菌Fab'片段作用下的生长曲线。
具体实施方式
疫原辅以完全福氏佐剂于双翅膀皮下、双大腿肌肉多处注射进 行免疫，首次免疫后每两周加强免疫1次，共计免疫4次。首次免疫后2周开 始收集鸡蛋并保存备用。
(2) 取步骤(1)所得鸡蛋的蛋黄液，加入蛋黄液9倍体积的水溶解，调节 pH5.0 、 4'C放置6小时;
(3) 4。C下10000转/分离心25min，取上清液；
(4) 加入18%硫酸钠，溶解，室温放置lh;
(5) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；
(6) 以与步骤(2)所用蛋黄液等体积的0.01M、 pH7. 4的PBS溶解沉淀，加 入14%硫酸钠，溶解，室温放置lh;
(7) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；
(8) 按步骤(7)所得沉淀质量的20倍加入胃蛋白酶，并用水溶解，调节溶 液pH3.5，加入适量甲苯，3(TC水浴反应1.5h;
(9) 加入15%硫酸铵后调节pH5.0、 57'C加热30min，然后迅速降温至45 'C以下；
(10) 4。C下10000转/分离心15min，取上清液；
(11) 调节上清液pH7.2，加入20%硫酸铵，4。C下8000转/分离心15min， 取沉淀；
(12) 用去离子水溶解沉淀，加明矾至明矾在溶液中的浓度为0.8
lg/100ml，调节pH7.8， 4。C下8000转/分离心15min，取上清液；
(13)加入38%硫酸铵，4'C下8000转/分离心15min，取沉淀透析过滤除菌 即可。
将上述方法获得的蛋黄液提取物通过紫外光双波长测定出提取物中蛋白含量 平均为2. 85mg/ml原始卵黄液；SDS-PAGE电泳显示卵黄液提取物基本呈现为一 条十分清晰的蛋白质条带，通过凝胶成像仪扫描显示其纯度高达95%以上，比对 标准蛋白质电泳条带测定其分子量约为44kDa。
例2本发明抗绿脓杆菌Fab'片段的鉴定
1、间接ELISA法检测出抗绿脓杆菌Fab'最高阳性效价为1: 25600。 将抗绿脓杆菌Fab，倍比稀释为1/400、 1/1 600、 1/6 400、 1/25 600、 1/51 200、 1/102 400，间接ELISA反应检测其在450nm下吸光度值，具体结果如图1 所示，以稀释倍数的对数值为横轴，以吸光度为纵轴作一光滑曲线，可以看出吸 光度改变与稀释倍数基本呈一条斜线)。间接ELISA法检测抗内毒素Fab'的效 价阳性判断(实测OD值—空白对照OD值)/ (阴性对照OD值—空白对照OD值) >2. 1。阴性对照为未免疫鸡Fab' (1: 100)。根据阳性判定标准得出Fab'的最 高阳性效价为1: 25600。
例l本发明抗绿脓杆菌Fab'片段的制备
本发明所述的抗绿脓杆菌Fab'片段是从用绿脓杆菌作为抗原免疫的产蛋鸡 的鸡蛋中提取得到的，具体方法是
(1) 绿脓杆菌(ATCC27853，西南医院检验科保存标准菌种)经纯培养后调 成1.5X108/ml菌液后超声粉碎后作为免疫原备用。25周龄来亨鸡常规饲养一 周后开始免疫。将免疫原辅以完全福氏佐剂于双翅膀皮下、双大腿肌肉多处注射 进行免疫，首次免疫后每两周加强免疫1次，共计免疫4次。首次免疫后2周 开始收集鸡蛋并保存备用。
(2) 取步骤(1)所得鸡蛋的蛋黄液，加入蛋黄液9倍体积的水溶解，调节 pH5.0 、 4。C放置6小时；
(3) 4。C下10000转/分离心25min，取上清液；
(4) 加入18%硫酸钠，溶解，室温放置lh;
(5) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；
(6) 以与步骤(2)所用蛋黄液等体积的0.01M、 pH7.4的PBS溶解沉淀，加 入14%硫酸钠，溶解，室温放置lh;
(7) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；
(8) 按步骤(7)所得沉淀质量的20倍加入胃蛋白酶，并用水溶解，调节溶 液pH3.5，加入适量甲苯，30。C水浴反应1.5h;
(9) 加入15%硫酸铵后调节pH5.0、 57。C加热30min，然后迅速降温至45 'C以下；
(10) 4。C下10000转/分离心15min，取上清液；
(11) 调节上清液pH7.2，加入20%硫酸铵，4。C下8000转/分离心15min， 取沉淀；
(12) 用去离子水溶解沉淀，加明矾至明矾在溶液中的浓度为0.8 lg/100ml，调节pH7. 8， 4。C下8000转/分离心15min，取上清液；
(13) 加入38%硫酸铵，4t:下8000转/分离心15min，取沉淀透析过滤除菌 即可。
将上述方法获得的蛋黄液提取物通过紫外光双波长测定出提取物中蛋白含量 平均为2. 85mg/ml原始卵黄液；SDS-PAGE电泳显示卵黄液提取物基本呈现为一 条十分清晰的蛋白质条带，通过凝胶成像仪扫描显示其纯度高达95%以上，比对 标准蛋白质电泳条带测定其分子量约为44kDa。
例2本发明抗绿脓杆菌Fab'片段的鉴定
1、间接ELISA法检测出抗绿脓杆菌Fab，最高阳性效价为1: 25600。 将抗绿脓杆菌Fab，倍比稀释为1/400、 1/1 600、 1/6 400、 1/25 600、 1/51 200、 1/102 400，间接ELISA反应检测其在450nm下吸光度值，具体结果如图1 所示，以稀释倍数的对数值为横轴，以吸光度为纵轴作一光滑曲线，可以看出吸
光度改变与稀释倍数基本呈一条斜线)。间接ELISA法检测抗内毒素Fab'的效 价阳性判断(实测0D值 一 空白对照0D值)/ (阴性对照0D值 一 空白对照0D值) 〉2.1。阴性对照为未免疫鸡Fab， (1: 100)。根据阳性判定标准得出Fab'的最 高阳性效价为1: 25600。 2、免疫印迹试验检测
(1) 准备好转移装置及PVDF膜，再按以下顺序从正极到负极依次叠放1 张加厚滤纸+PVDF膜+凝胶+l张加厚滤纸，将负极放于夹层物上，石墨一边朝下。 连接电源，以120mA电转20min。
(2) 断开电源并拔下槽上插头，从上到下拆卸转移装置，将凝胶转移至考马 斯亮蓝染液中进行染色，以便检查蛋白质转移是否完全。
(3) 切去PVDF膜左下角，以标记方向。将PVDF膜放入可以加热封闭的塑料 袋中(内有封闭液)，尽可能排除里面的气泡，然后密闭袋口，平放在平缓摇动 的摇床上于37。C温育lh。
4.取出PVDF膜，再用去离子水洗涤5min。将PVDF膜与兔抗鸡IgY酶标二抗 (稀释l: 1000) 37X:温育lh，加入底物溶液显色20min，风干保存。
如图2所示，本发明抗绿脓杆菌Fab'片段可以与兔抗鸡IgG酶标二抗结合 后与底物发生反应，表明抗绿脓杆菌Fab'与鸡IgG具有相同抗原性，同时对抗 原绿脓杆菌有良好的特异性。
例3本发明抗绿脓杆菌Fab'片段的体外生物学效应实验
1、 实验方法
实验分2组，其中一组为对照组3. 9X 105cfu/ml绿脓杆菌液于37"C恒温箱 中孵育，于6、 12、 24、 36h，取样后活菌计数。另一组为本发明Fab'片段拮抗 组将绿脓杆菌(3.9X105cfu/ml)分别加入本发明Fab，片段5、 10、 20mg/ml， 于6、 12、 24、 36h，取样后活菌计数。
2、 实验结果如图3所示，抗绿脓杆菌Fab'能明显抑制绿脓杆菌的生长， 具有良好的体外生物学效应。
权利要求
1、抗绿脓杆菌Fab’片段，其特征在于(1)所述抗绿脓杆菌Fab’片段能特异性结合绿脓杆菌；(2)所述抗绿脓杆菌Fab’片段是通过以下方法获得的用绿脓杆菌作为抗原免疫产蛋鸡后收集所产的蛋，然后从其卵黄中分离水溶部分，并用硫酸钠沉淀，取沉淀物，最后用胃蛋白酶水解沉淀物，收集分子量为44道尔顿的水解产物。
2、 权利要求l所述的抗绿脓杆菌Fab'片段的制备方法，该方法由以下 步骤组成(1) 用绿脓杆菌作为抗原免疫的产蛋鸡，取其蛋，分离出蛋黄液；(2) 加入蛋黄液9倍体积的水溶解蛋黄液，调节pH5.0 、 4'C放置6小时；(3) 4。C下10000转/分离心25min，取上清液；(4) 加入18%硫酸钠，溶解，室温放置lh;(5) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；(6) 以与步骤(2)所用蛋黄液等体积的0. OIM、 pH7. 4的PBS溶解沉淀， 加入14Q^硫酸钠，溶解，室温放置lh;(7) 常温下10000转/分离心15min，取沉淀；(8) 按步骤(7)所得沉淀质量的20倍加入胃蛋白酶，并用水溶解，调 节溶液pH3.5，加入适量甲苯，3(TC水浴反应1. 5h;(9) 加入15X硫酸铵后调节pH5.0、 57'C加热30min,然后迅速降温至 45。C以下；(10) 4。C下10000转/分离心15min，取上清液；(11) 调节上清液pH7. 2，加入20X硫酸铵，4。C下8000转/分离心15min， 取沉淀；(12) 用去离子水溶解沉淀，加明矾至明矾在溶液中的浓度为0.8 lg/100ml，调节pH7.8， 4。C下8000转/分离心15min，取上清液；(13)加入38%硫酸铵，4'C下8000转/分离心15min，取沉淀透析过滤 除菌即可；上述方法中的物质百分比浓度均为质量/体积百分比。 3、权利要求l所述的抗绿脓杆菌Fab'片段在制备治疗绿脓杆菌感染药 物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种针对绿脓杆菌的特异性抗体——抗绿脓杆菌Fab’片段，该抗绿脓杆菌Fab’片段是从用绿脓杆菌作为抗原免疫的产蛋鸡的鸡蛋中提取得到的，具有产量高、效价好、理化性质稳定、特异性强且制备简单方便、重复性好、适于工业化生产等优点，并通过相关的体外实验证明本发明抗绿脓杆菌Fab’显著拮抗绿脓杆菌的生长，可用于制备治疗绿脓杆菌感染的药物。
文档编号C07K16/04GK101186648SQ200710093130
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者颖 庄, 张雅萍, 马思远 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院