专利名称：绿脓杆菌msha菌毛株及其建立的制作方法
专利说明 本发明涉及一种微生物，特别是绿脓杆菌。
本发明的绿脓杆菌MSHA菌毛株全称为铜绿假单胞杆菌(Ps.aeruginosa)甘露糖敏感血凝菌毛株，它是一种具有周菌毛性MSHA(Mannose Sensitive Hemagglu tination)菌毛的绿脓杆菌，该菌毛株具有跨菌属的广谱免疫原性。
在InfectImmun 1980;40∶670报导了1975年日本学者本间逊曾发现绿脓杆菌的死菌体有免疫调节作用，其死菌注射到动物体内能激发体液及细胞免疫状态，诱导生成干拢素并具有分裂原作用，还能诱导动物抵抗接种的癌细胞的生长，但因该菌菌体毒性太大，免疫效价低，又无周菌毛性MSHA菌毛跨菌属高效广谱免疫原性特征，故无法实际应用。1980年以色列学者Gilboa-Garber教授在In Adhesion and micrcorganismpathogenicity cida foundation symposium 80.Pitman Medical p119～141.1981进一步阐明绿脓杆菌的染色体基因不能表达周菌毛性MSHA菌毛株的表型特征，原因可能是绿脓杆菌在结构上与其它革兰氏阴性菌不同，缺乏将其MSHA凝集素钩挂到细菌体表面上的基因，因而不可能出现绿脓菌活培养物的MSHA阳性株。
本发明的目的在于提供一种MSHA阳性绿脓杆菌菌毛株及其建株的方法。
绿脓杆菌MSHA菌毛株，其特征在于 a、在菌体周围有许多纤细而刚直的菌毛， b、MSHA试验呈强阳性， c、平板菌落粘附红细胞试验强阳性， d、酵母菌的直接凝集试验呈MS血凝。
2.绿脓杆菌MSHA菌毛株的建立，其特征在于 ①降低绿脓杆菌的毒力 a、以自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株为样本， b、用普通培养基和药液组成的混合培养基中在37～41℃培育5～20天经200次以上传代， ②周身性MSHA菌毛的表达 a、提取细胞染色质DNA采用反复冻化及SDS综合法协同进行破坏菌体，然后脱去蛋白质， b、获得DNA小片段取上述减毒菌株的染色体DNA采用PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶在65℃酶切1～2小时， c、使DNA小片段重新随机接合取含有DNA小片段的液体加入0.3%～0.5%连接酶，在0～12℃作用1～12天， d、DNA解双链并除菌向上述重新接合有长链DNA的液体中加入PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合解链酶在65℃酶切约5分钟，然后采用常规方式灭菌， e、将单链的DNA与减毒菌体结合将上述解去双链的DNA液加入到含有CaCl2的减毒菌株内在加有2%琼脂的普通培养基中于37～41℃共同培育。
本发明主要是对绿脓杆菌进行连续传代使之毒力降低，再应用基因工程法实现周身性MSHA菌毛的表达。
本发明绿脓杆菌MSHA菌毛株的建立 一、降低绿脓杆菌的毒力 本发明是以自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株(LD30＝107个活菌)为样本，在普通培养基中如采用由0.3%肉膏、牛肉浸液、1%的蛋白胨和0.5%的氯化钠构成的培养基(PH＝7.4～7.6)经高压灭菌后的产物中再加入药液。该药液可以是西药中的抗菌素药物如庆大霉素、多粘菌素等，也可以是中药里的清热解毒药物如海蚌含珠、紫花地丁、丹皮、鬼针草、苦菜及黄芪等。将上述药液加到普通培养基中使之浓度低于抑菌浓度。这些药物的杀菌浓度各不相同，取其杀菌浓度的十分之一作为抑菌浓度，使之产生抗药性以减低毒力。在37～41℃的温度条件下培育5～20天传代一次，多次重复上述操作经过200代后其毒力减低到可供制备菌苗之用。其毒性虽较原始菌样本株的毒力下降了，但仍保持原有完整免疫原性，即注射小白鼠非致死量后仍然能形成足够的特异性抗体和细胞免疫。
二、周身性MSHA菌毛的表达 细菌染色质DNA的提取反复冻化及SDS(磺酸十二烷钠盐)综合法协同进行破坏菌体，即将上述减毒的绿脓杆菌置于蒸馏水中冷却使之冻结成冰之后再将其融化，与此同时还需在蒸馏水中加入SDS药物进行腐蚀，以加速细菌细胞壁的破坏，反复进行多次才可破坏菌体。之后脱去蛋白质向被破坏的菌体内加入氯仿一异戊醇，则蛋白质呈絮状沉淀析出。离心分离去除蛋白质留取上清液。最好再用稀盐酸溶解颗粒性物质，使其内所包容的DNA游离出来，以增加DNA的收率。将含DNA的上清液用乙醇水溶液洗涤多次，除去盐份即可得到纯化的减毒菌株的染色体DNA。可用电子显微镜(×100万倍)检查有无DNA遗传基因。
DNA小片段的获得对上述减毒株的染色体DNA采用PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶在65℃酶切1～2小时，使其成为小片段。取含有DNA小片段的液体加入0.3～0.5%连接酶，在0～12℃作用1～12天，使各种细小的DNA片段重新随机接合成长链DNA(双链)用电子显微镜检查接合情况，如果没有接上，更换连接酶再重复进行。向上述重新接合有长链DNA的液体中加入解链酶，即上述内切酶如PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶在65℃酶切约5分钟，使长链DNA变成单链，以便进到活菌体中去。然后采用常规的灭菌方式如采用滤膜或滤器除去任何菌体。将上述解去双链余下单链的DNA液加到含有常规浓度的CaCl2的减毒菌株内，在普通培养基中即0.3%肉膏、牛肉浸液、1%蛋白胨和0.5%氯化钠的混合物中再加入2%琼脂，于37～41℃共同培育反复克隆，即可得到绿脓杆菌MSHA菌毛株。
该细菌经生物工程技术修饰后带上了周身性MSHA菌毛，具有广谱高效价跨越菌属的免疫原性。其毒力仅为原始非MSHA菌毛株的1/80。使用本菌毛株的死菌可制成低毒性的广谱免疫代谢调节剂，注射于人体，在帮助人体激活免疫系统抵抗多种致病微生物感染的同时，还能使人体恢复免疫代谢平衡状态，既能抗菌也能抗病毒感染;既能调节免疫低下状态防治反复发作性尿路和呼吸道疾患和恶性肿瘤也能调节免疫亢进状态防治超敏感性疾患(如哮喘、银屑病、硬皮病、迁延性乙型肝炎)。
图面说明如下
图1是本发明绿脓杆菌MSHA菌毛株的电子显微镜照片(29000×) 图2是本发明绿脓杆菌半固体形态的照片。
图3是本发明绿脓杆菌与其它菌的氧化酶试验对比结果照片。
图4是本发明绿脓杆菌的色素对比结果照片。
图5是本发明绿脓杆菌的MSHA菌毛株的电子显微镜照片(29000×) 图6是本发明绿脓杆菌的MSHA菌毛株的MSHA玻片凝集直接观察呈MSHA阳性照片。
图7是本发明绿脓杆菌的MSHA菌毛株MSHA受甘露糖抑制后呈现MSHA阴性结果照片。
图8是本发明绿脓杆菌的MSHA菌毛株的直接凝集酵母和表面粘附试验的光学显微镜照片(1000×) 图9是本发明绿脓杆菌非MSHA菌毛株直接凝集酵母菌和表面粘附试验的光学显微镜照片(1000×) 实施例 取自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株(LD＝107个活菌)为样本，在由0.3%肉膏、牛肉浸液、1%的蛋白胨和0.5%的氯化钠构成的培养基(PH＝7.5)经高压灭菌后再加入药液。该药液为2-8%黄芪及1%鬼针草的混合液在37～41℃的温度条件下培育5～20天传代一次。经过462次传代的绿脓杆菌的毒力采用昆明种14～18克小白鼠测得LD50＝9×108个活菌。将上述减毒的绿脓杆菌置于蒸馏水中冷却使之冻结成冰之后再将其融化，与此同时还需在蒸馏水中加入SDS药物，经反复多次可使菌体破坏。然后向被破坏的菌体内加入氯仿-异戊醇，则蛋白质呈絮状沉淀析出。离心分离去除蛋白质留取上清液，再用稀盐酸溶解颗粒性物质。将含有DNA的上清液用乙醇水溶液多次洗涤除去盐份即可得到纯化的减毒菌株的染色体DNA。用电子显微镜(×100万倍)检查有无DNA遗传基因。对上述减毒株的染色体DNA采用PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶，在65℃酶切1～2小时，使其成为小片段。取含有DNA小片段的液体加入0.3～0.5%连接酶，在0～12℃作用1～12天，使各种细小的DNA片段重新随机接合成长链DNA(双链)。用电子显微镜检查接合情况。向上述重新结合有长链DNA的液体中加入PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶，在65℃酶切约5分钟。然后用滤膜过滤，将滤液加到含有5%浓度的氯化钙的减毒株内，在由0.3%肉膏、牛肉浸液、1%蛋白胨0.5%氯化钠及2%琼脂的培养基中，于37～41℃共同培养反复克隆即可得到绿脓杆菌的MSHA菌毛株。
上面得到的本发明绿脓杆菌具有绿脓杆菌的全部菌学特征如下表所示
本发明的绿脓杆菌MSHA菌毛株又具有与绿杆菌非MSHA菌毛株不同的菌学特征见下表
本发明的应用用该菌毛株制成菌苗或免疫调节剂安全可靠无毒害菌苗制剂注射小白鼠150亿个死菌体未见任何毒性反应，人体使用的最大量仅为小白鼠的1/10即16亿，十分安全，临床治疗万余病例未见一例中毒和过敏者，上述菌苗或免疫调节剂中含有多种对人体有利的易吸收的物质如维生素B、维生素E、微量元素、锌、铜、铁、钙及磷等。该菌苗免疫动物能全面激发动物的细胞和体液免疫系统;不仅能抵抗绿脓杆菌感染也能跨越多个菌属抵抗变形杆菌、大肠杆菌、肺炎杆菌及伤寒杆菌等的攻击。菌苗免疫动物及志愿人员其广谱抗体效价100%提高4倍以上。较菌苗免疫前广谱抗体的效价提高30～256倍。免疫调节活性及抗肿瘤作用均具明显效果。该菌苗应用于临床如防治呼吸道反复感染及哮喘控制率达80%以上。治疗反复性慢性泌尿路感染治疗率达75～98%、治疗银屑病治愈率为60.3%比国际常规治愈率高53%。另对胆囊炎、迁延性胰腺炎、大面积烧伤及慢性反复性结肠炎也疗效显著。
本发明的绿脓杆菌MSHA菌毛株又具有与绿杆菌非MSHA菌毛株不同的菌学特征见下表
本发明的应用用该菌毛株制成菌苗或免疫调节剂安全可靠无毒害菌苗制剂注射小白鼠150亿个死菌体未见任何毒性反应，人体使用的最大量仅为小白鼠的1/10即16亿，十分安全，临床治疗万余病例未见一例中毒和过敏者，上述菌苗或免疫调节剂中含有多种对人体有利的易吸收的物质如维生素B、维生素E、微量元素、锌、铜、铁、钙及磷等。该菌苗免疫动物能全面激发动物的细胞和体液免疫系统;不仅能抵抗绿脓杆菌感染也能跨越多个菌属抵抗变形杆菌、大肠杆菌、肺炎杆菌及伤寒杆菌等的攻击。菌苗免疫动物及志愿人员其广谱抗体效价100%提高4倍以上。较菌苗免疫前广谱抗体的效价提高30～256倍。免疫调节活性及抗肿瘤作用均具明显效果。该菌苗应用于临床如防治呼吸道反复感染及哮喘控制率达80%以上。治疗反复性慢性泌尿路感染治疗率达75～98%、治疗银屑病治愈率为60.3%比国际常规治愈率高53%。另对胆囊炎、迁延性胰腺炎、大面积烧伤及慢性反复性结肠炎也疗效显著。
注本发明中的百分比除特殊注明外均为重量百分比。
权利要求
1、绿脓杆菌MSHA菌毛株，其特征在于
a、在菌体周围有许多纤细而刚直的菌毛，
b、MSHA试验呈强阳性，
c、平板菌落粘附红细胞试验强阳性，
d、酵母菌的直接凝集试验呈MS血凝。
2、绿脓杆菌MSHA菌毛株的建立，其特征在于
①降低绿脓杆菌的毒力
a、以自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株为样本，
b、用普通培养基和药液组成的混合培养基中在37～41℃培育5～20天经200次以上传代，
②周身性MSHA菌毛的表达
a、提取细胞染色质DNA采用反复冻化及SDS综合法协同进行破坏菌体，然后脱去蛋白质，
b、获得DNA小片段取上述减毒菌株的染色体DNA采用PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶在65℃酶切1～2小时，
c、使DNA小片段重新随机接合取含有DNA小片段的液体加入0.3%～0.5%连接酶，在0～12℃作用1～12天，
d、DNA解双链并除菌向上述重新接合有长链DNA的液体中加入PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合解链酶在65℃酶切约5分钟，然后采用常规方式灭菌，
e、将单链的DNA与减毒菌体结合将上述解去双链的DNA液加入到含有CaCl2的减毒菌株内在加有2%琼脂的普通培养基中于37～41℃共同培养。
全文摘要
绿脓杆菌MSHA菌毛株为一种具有周菌毛性MSHA菌毛的绿脓杆菌，即在菌体周围有许多纤细而刚直的菌毛。 MSHA试验呈强阳性，平板菌落粘附红细胞试验呈强阳性，酵母菌的直接凝集试验呈MS血凝。该绿脓杆菌MSHA菌毛株的建立是以自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株为样本经过几百次以上传代降低毒力，然后再采用生物工程技术使之带上了周身性MSHA菌毛，其具有广谱高效价跨越菌属的免疫原性，而毒力仅是原始菌毛株的1/80。
文档编号C12N15/32GK1090602SQ9310011
公开日1994年8月10日 申请日期1993年2月6日 优先权日1993年2月6日
发明者牟希亚, 郭雁群 申请人:牟希亚, 郭雁群