专利名称：一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种疫苗及其制备方法。
背景技术：
水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年8-11月份水貂换毛季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发送，每年可造成养殖场20%-40%的死亡率，是危害水貂养殖业的中药细菌性传染病。该病病原为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)中的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginolsa),亦称为绿胺杆菌(Bacterium pyocyaneum),为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生色素，使菌落周围琼脂培养基着色。绿脓杆菌广泛分布于土壤、水和空气中，在正常人与动物肠道和皮肤上亦有存在，也易从外伤、烧伤及尿道感染等发现，能引起人的烧伤感染和患囊性纤维化病人的肺部感染，具有多种致病因子而且有强侵袭力。水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生耐药性，因此需要有效的疫苗来预防，国外有报道将细菌细胞壁提取物(JAMES E. PENNINGTON, 1979)加类毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。
发明内容
步骤I :将铜绿假单胞菌菌株Pal株和铜绿假单胞菌菌株Pa3株分别接种于发酵培养基培养，调整菌数为200-250亿CFU/mL按比例I :1混合；
步骤2 :灭活步骤I所得混合培养物；
步骤3 :在步骤2所得培养物中添加蜂胶佐剂，即得所述水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。作为优选，步骤I所述接种为按发酵培养基体积的2%接种菌株。作为优选，步骤I所述培养为在37°C通气搅拌培养12_16h，控制绿脓杆菌的培养时间在16h以内，防止培养时间过长导致绿脓杆菌外毒素的产生，更好地保障疫苗安全性。作为优选，步骤2所述灭活为用终浓度O. 5%的甲醛灭活，于37°C灭活24h。作为优选，步骤3所述佐剂为蜂胶溶液。本发明所述铜绿假单胞菌菌株Pal株和Pa3株混合制成的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗，一次可达到80%以上保护率，免疫期可达到五个月，其制备工艺简单，适合商品化生产，具有良好的应用前景。
本发明的绿脓假单胞菌(铜绿假单胞菌)购自中国兽医药品监察所菌种室，分别为绿脓假单胞菌(铜绿假单胞菌)Pal，2007. 7. 10.冻干；绿脓假单胞菌(铜绿假单胞菌)Pa3，2007. 7. 10.冻干。
具体实施例方式发酵培养基蛋白胨2%，牛肉膏O. 6%，氯化钠O. 5%，葡萄糖O. 5%，用去离子水配成，配完调PH值7. 4-7. 6，112°C 30min,灭菌后按照培养基的2%加入健康胎牛血清。实施例I
疫苗制备将中国兽医药品监察所菌种室购买的铜绿假单胞菌菌株Pal株和Pa3株用营养肉汤溶解后，分别接种于斜面培养基上，37°C培养24小时，取培养物分别划线接种于含十六烷三甲基溴化铵的平板上，37°C培养16-18小时，经纯检合格后，作为一级种子，分别接种于含O. 3%牛肉膏和2%胎牛血清的营养肉汤培养基，37°C培养16-18小时，取样经纯粹检验合格后，作为二级种子，将二代种子按2%比例接种于发酵罐，按发酵罐容积总量装入70%的发酵培养基与O. 01%的消泡剂，搅拌速度为150转/分，37°C培养16-18小时，即为培养好的疫苗菌液，分别取样用适宜培养基进行纯粹检验，同时取样进行活菌计数，调整每种菌液含活菌数为200-250亿CFU/mL，之后将菌液按菌株Pal株和Pa3株比例为I: I混合，混合后加终浓度为O. 5%的甲醛37°C灭活24h。疫苗灭活检验将甲醛灭活后的菌液取100微升接于3ml液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。实施例2
将实施例I制备好的三批疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量注射健康水貂，后肢内侧肌肉接种。通过14d观察，接种水貂体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应每批疫苗选择3只，剖杀后切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，水貂接种部位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，仅见到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，与周围红褐色肌肉相区别，注射部位未见炎症反应。60-70日龄幼貂继续观察至接种后30d，幼貂发育良好。说明疫苗对不同年龄的水貂具有较好的安全性。实施例3
三批水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗分别免疫16-18g小白鼠20只，实验组和对照组各10只，O. 2mL/只，免疫后21d连同对照组小白鼠20只分别用ZC株、RC株攻毒，观察7日，三批疫苗免疫组小白鼠均100%获得保护，对照组小白鼠均100%发病。三批水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗分别免疫2-10月龄的健康水貂，每批疫苗肌肉接种水貂10只，ImL/只，免疫后21日连同对照组水貂10只分别用Pal株和Pa3株，通过气管内滴入攻毒(每个组别5只)，观察7日，三批疫苗免疫组水貂均100%获得保护，对照组水貂均100%发病。实施例4
采用三批蜂胶灭活疫苗进行免疫保护期测定。分为实验组和对照组，实验组分六组，每组30只水貂，用本发明所述三批蜂胶灭活疫苗免疫，每批疫苗免疫10只水貂，每后肢内侧肌肉注射ImL ;对照组分为六组，每组10只水貂，后肢内存肌肉注射生理盐水对lmL，免疫 后的第1-6个每月用Pal株和Pa3株分别攻毒(每株接种5只水貂)，分别测定疫苗对这两种毒株的保护力。实验结果表明，本发明所述蜂胶灭活疫苗对水貂抗绿脓杆菌Pal株的保护期为6个月，免疫保护率在80%以上，对水貂抗绿脓杆菌Pa3株的保护期5个月，免疫保护率在80%以上。
权利要求
1.一种水貂绿脓杆菌蜂胶疫苗，其特征在于主剂为绿脓杆菌Pal株和Pa3株，佐剂为蜂胶。
2.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于疫苗浓度为含菌量100亿CFU/ml，含蜂胶干物质10 15mg/ml。
3.权利要求I所述的水貂绿脓杆菌蜂胶疫苗的制备工艺，其特征在于所述的制备工艺包括如下步骤 一、制备菌液， 二、制备蜂胶液， 三、配置疫苗，取菌液保存液与蜂胶保存液混合成黄色混悬液，分装后密封保存。
4.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于制备菌液步骤主要由下述步骤完成 将绿脓杆菌Pal株和Pa3株加入到含2%胎牛血清的发酵培养基中，37°C培养16-18小时，调整到菌液浓度为200亿 250亿活菌/ml.再加入甲醛溶液使最终浓度为O. 5%，放在37°C中灭活24小时制成灭活菌苗备用。
5.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于制备蜂胶液步骤主要由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。
6.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于黄褐色混悬液，密封保存于4-8°C中。
7.权利要求I所述的水貂绿脓杆菌蜂胶疫苗的用途，主要是用于水貂绿脓杆菌的免疫。
全文摘要
本发明公开了一种由两种绿脓杆菌菌株制备的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。将所述绿脓杆菌菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1∶1比例混合，加蜂胶制备水貂蜂胶绿脓杆菌二价灭活疫苗。本发明所述绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗用于预防水貂出血性肺炎免疫效果好，可获得至少五个月的保护期，保护率在80％以上，具有良好的应用前景。
文档编号A61K39/104GK102626516SQ20121009585
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者单虎, 张传美, 张启迪, 秦晓冰, 蔡秀磊, 黄娟 申请人:青岛农业大学