一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，按如下步骤制得：菌种准备及细菌的增殖；制备灭活菌苗；产蛋鸡的免疫；高免蛋的收集；提取抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药；效价、安全检验，形成产品。本发明用水貂绿脓杆菌性肺炎病原菌的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取蛋白质，对水貂绿脓杆菌性肺炎具有特异性的预防和治疗作用，不仅不产生耐药性，在体内不存在药物残留，而且该药物药效期长，使用成本低，治愈率高，存活数大。
【专利说明】一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水貂兽药的制备方法，尤其涉及预防和治疗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法。
【背景技术】
[0002]水貂绿脓杆菌性肺炎是由绿脓杆菌引起的严重危害2~7周龄小水貂的一种细菌性传染病，发病率高(5~90%)，死亡率高(I~80%)，即便没有死亡的小水貂也会体重减轻，生长迟缓，给水貂饲养业造成严重的经济损失。该病呈世界性分布，在所有养水貂国家和地区流行且危害严重。我国兽医专家郭玉璞于1982年在北京首次确认此病以来，现在全国许多省区(如四川、重庆、北京、上海、浙江等)都相继有本病的报道。
[0003]抗菌药物防治是当前防治水貂绿脓杆菌性肺炎的一项最重要的措施，但其存在许多不足:由于绿脓杆菌对抗菌药物易产生耐药性，各地分离的菌株对抗菌药物的敏感性不完全相同，甚至差别很大，致使抗菌药的应用受到一定的限制。
[0004]要想获得针对某一水貂饲养场或地区的水貂绿脓杆菌性肺炎具有很好疗效的药物，必须从该地区或饲养场的病死水貂中分离出病原(绿脓杆菌)，再进行体外药物敏感性试验，操作复杂和费时，在我国基层兽医工作中基本不能实现。另外，用药物治疗水貂绿脓杆菌性肺炎需要连续反复给药，治疗成本高，如用高霉素治疗水貂绿脓杆菌性肺炎，每只水貂的药物费用在0.25~0 .35元。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:提供一种疗效好，成本低的抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药的制备方法。
[0006]本发明的技术解决方案是:一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药的制备方法，其步骤是:
1、一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，其特征在于:按如下步骤制得:
(I)菌种准备及细菌的增殖
将真空冻干保存的绿脓杆菌用生理盐水(生理盐水为重量体积比为0.9%的氯化钠水溶液)按体积比1:1稀释，接种于NAC琼脂培养基，在37°C的培养箱中培养18~24小时，经纯度检验没有杂菌生长后，用生理盐水制成菌悬液接种于LB琼脂培养基，37°C的培养箱中培养36~48小时后，收集细菌。
[0007]所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取混合:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂12.0g/L，加700_800ml蒸馏水溶解，然后加蒸馏水补至1000ml，116°C高压灭菌30min后备用。
[0008](2)制备灭活菌苗
将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬液，即把在培养基上生长的细菌菌落加入到生理盐水中混匀，使每毫升菌悬浮含150~200亿个细菌，用终浓度重量体积比为0.3%的甲醛在37°C下灭活24小时，即为制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳剂灭活菌苗，并进行灭活菌苗的安全检验；
(3)产蛋鸡的免疫
选25周龄的健康产蛋母鸡用安全检验合格的灭活菌苗进行免疫，免疫程序为:
第1次免疫:每只鸡腿肌注射0.2ml，颈部皮下注射0.2ml,
第2次免疫:2周后每只鸡颈部皮下注射1.0ml,
第3次免疫:2周后，每只鸡颈部皮下多点注射1.5ml ；
(4)高免蛋的收集
产蛋鸡第3次免疫后14天，开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体效价，蛋黄与生理盐水按体积比1: 3稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价> I: 16即为合格，之后收集鸡蛋；
(5)提取抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药
A、蛋壳消毒:将鸡蛋浸入加热至42°C的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒25~35分钟，取出凉干或吹干备用；
B、打蛋分离蛋黄:采用手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集蛋黄；
C、萃提:先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍体积的高压的灭菌生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋`黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，静置60分钟后以3500~4000rpm用离心机离心30分钟，收集离心管中的上清液；
D、加入灭活剂和稳定剂:上清液按终浓度体积比为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封30~60分钟后加入终浓度重量体积比为0.02%的稳定剂吐温-20，混匀；
E、除菌过滤:用0.2~0.3um微孔滤膜过滤除菌，即得到抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药，主要成分是卵黄抗体；
(6)效价、安全检验，形成产品
效价用含8%Nacl的1%琼脂，即用8%氯化钠溶液配制的琼脂，琼脂的含量是1%，1%为重量体积比，为载体的琼扩试验检测，检测用抗原为绿脓杆菌脂多糖抗原，抗原含量为150~200mg/ml ； 18~20g小鼠3只做安全性检验，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，观察7天，无任何异常反应为合格。
[0009]在上述步骤(1)的菌种准备及细菌的增殖中，所述NAC琼脂培养基的配制方法:按如下所需组分重量称取，蛋白胨20.0g/L,硫酸镁0.2g/L，十六烷基三甲基溴化铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，琼脂12.0g/L，然后将蛋白胨、硫酸镁、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸氢二钾、萘啶酮酸、琼脂混合成NAC琼脂混合物，称取所述NAC琼脂混合物33克，加蒸馏水1000ml，加热煮沸直至混合物全部溶解，摇匀，倾注平板，用于假单胞菌属分离培养；所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠 5g/L，琼脂 12.0g/L。
[0010]在上述步骤(2)的制备灭活菌苗中，乳化是指先分别制备油相和制备水相，再按体积比1:3混合乳化，其中:制备油相，取94ml的10号白油，6ml的司本_80，硬脂酸铝2g,先将硬脂酸铝与20~30ml白油混合加热到70~80°C熔化后，再补足剩余10号白油及加入司本-80充分搅拌分装，在温度116°C下灭菌30分钟，最后在10°C冷藏备用；制备水相，取96ml灭活菌抗原悬液，4ml的吐温-80 ;乳化按3ml油相和Iml水相配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，在30~50转/分钟的慢速下搅拌，缓缓加入水相之后在180~200转/分钟的高速下搅拌2~5分钟，在终止搅拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液终浓度为万分
之一 O
[0011]本发明的技术效果是:本发明提供一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药，通过用水貂绿脓杆菌性肺炎病原菌(绿脓杆菌)的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质，将该蛋白质用于防治水貂绿脓杆菌性肺炎，来解决用抗菌药物防治水貂绿脓杆菌性肺炎存在的易产生耐药菌株、需连续反复给药及成本高的问题。
[0012]另外，用水貂绿脓杆菌性肺炎病原菌(绿脓杆菌)的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质，它对水貂绿脓杆菌性肺炎具有特异性的预防和治疗作用及绿脓杆菌不对它产生耐药性。感染绿脓杆菌性肺炎病的水貂用本发明抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药治疗后，其体内不存在药物残留，该药物药效期长，可达5~7天，一般患病水貂用药一次即可治愈，使用成本低，每只病水貂的治疗成本在0.08~0.12元。因此，本发明抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药在水貂绿脓杆菌性肺炎的防治中具有特效，无残留，不产生耐药性，药效期长，价格低的特点，是一种“绿色”药物，在兽医公共卫生学上有重要意义。
[0013]本发明经实验证明取得显著成功，完全达到了发明的目的。它不仅不产生耐药性，在体内不存在药物残留，该药物药效期长，使用成本低，而且，治愈率高，存活数大。
[0014]下面是用本发明兽药对水貂传染性肺炎的预防和治疗试验情况说明: 试验一:400只14日龄小水貂，用不含抗菌药物的饲料饲喂，随机分成2组，每组200只；第I组试验水貂每只腿部肌注1.0 ml抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药，第2组试验水貂每只腿部肌注1.0 ml生理盐水:分别于注射后24小时，72小时，120小时及168小时从各组中随机抽取50只试验水貂用于攻毒试验，结果表明第I组试验水貂在24小时，72小时，120小时及168小时攻毒后存活率为100%。
[0015]试验二:用不含抗菌药物的饲料饲喂400只14日小水貂，随机分成4组，每组100
只，在实验室条件下人工感染水貂绿脓杆菌性肺炎。第1、2、3组试验水貂分别在感染后
12小时，24小时，36小时每只水貂腿部肌肉注射抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药1.0
ml治疗，第4组为空白对照，其结果为--第1、2、3组的治愈比分别为98/100 (98%)、85/92
(92.4%)、49/70 (70%)，第4组的存活数为O (0/1 00)。详见下表:
【权利要求】
1.一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，其特征在于:按如下步骤制得: (I)菌种准备及细菌的增殖 将真空冻干保存的绿脓杆菌用生理盐水按体积比1:1稀释，接种于NAC琼脂培养基，在37°C的培养箱中培养18~24小时，经纯度检验没有杂菌生长后，用生理盐水制成菌悬液接种于LB琼脂培养基，在37°C的培养箱中培养36~48小时后，收集细菌； (2)制备灭活菌苗 将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬液，使每毫升菌悬液含150~200亿个细菌，用终浓度0.3%甲醛在37°C下灭活24小时，即为制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳剂灭活菌苗，并进行灭活菌苗的安全检验； (3)产蛋鸡的免疫 选25周龄的健康产 蛋母鸡用安全检验合格的灭活菌苗进行免疫，免疫程序为: 第1次免疫:每只鸡腿肌注射0.2ml，颈部皮下注射0.2ml, 第2次免疫:2周后每只鸡颈部皮下注射1.0ml, 第3次免疫:2周后，每只鸡颈部皮下多点注射1.5ml ； (4)高免蛋的收集 产蛋鸡第3次免疫后14天，开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体效价，蛋黄与生理盐水按体积比1: 3稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价> I: 16即为合格，之后收集鸡蛋； (5)提取抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药 A、蛋壳消毒:将鸡蛋浸入加热至42°C的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒25~35分钟，取出凉干或吹干备用； B、打蛋分离蛋黄:打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集蛋黄； C、萃提:先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍体积的高压灭菌生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，静置60分钟后装入离心管以3500~4000rpm离心30分钟，收集离心管中的上清液； D、加入灭活剂和稳定剂:上清液按终浓度为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封30~60分钟后加入终浓度为0.02%的稳定剂吐温-20，混匀； E、除菌过滤:用0.2~0.3um微孔滤膜过滤除菌，即得到抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药； (6)效价、安全检验，形成产品 效价用含氯化钠的琼脂为载体进行琼扩试验检测，所述含氯化钠的琼脂是用8%氯化钠溶液配制的琼脂，琼脂的含量是1%，检测用抗原为绿脓杆菌脂多糖抗原，抗原含量为150~200mg/ml ；18~20g小鼠3只做安全性检验，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，观察7天，无任何异常反应为合格。
2.根据权利要求1所述一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，其特征在于:在步骤(1)的菌种准备及细菌的增殖中，所述NAC琼脂培养基的配制方法:按如下所需组分重量称取，蛋白胨20.0g/L,硫酸镁0.2g/L，十六烷基三甲基溴化铵0.2g/L，磷酸氢二钾.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，琼脂12.0g/L,然后将蛋白胨、硫酸镁、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸氢二钾、萘啶酮酸、琼脂混合成NAC琼脂混合物，称取所述NAC琼脂混合物33克，加蒸馏水至1000ml，加热(不用煮沸)直至混合物全部溶解，摇匀，倾注平板，用于假单胞菌属分离培养；所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取混合:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂12.0g/L，加700_800ml蒸馏水溶解，然后加蒸馏水补至1000ml，116 °C高压灭菌30分钟后备用。
3.根据权利要求1或2所述一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，其特征在于:在步骤(2)的制备灭活菌苗中，乳化是指先分别制备油相和制备水相，再按体积比1:3混合乳化，其中:制备油相，取94ml的10号白油，6ml的司本_80，硬脂酸铝2g，先将硬脂酸铝与20~30ml白油混合加热到70~80°C熔化后，再补足剩余10号白油及加入司本-80充分搅拌分装，在温度116°C下灭菌30分钟，最后在10°C冷藏备用；制备水相，取96ml灭活菌抗原悬液，4ml的吐温-80 ;乳化按3ml油相和Iml水相配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，在30~50转/分钟的慢速下搅拌，缓缓加入水相之后在180~200转/分钟的高速下搅拌2~5分钟，在终止搅拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液终浓度为万分之一。
【文档编号】A61P31/04GK103690951SQ201310748239
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】赵成新, 李晓丽, 王先德, 栾浩麟, 房超, 邹德志, 刘怀华 申请人:烟台金海药业有限公司