一种铜绿假单胞菌噬菌体及其在水貂出血性肺炎预防中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，一种铜绿假单胞菌噬菌体及其在水貂出血性肺炎预防中的应用。该铜绿假单胞菌噬菌体2014年4月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC?No.9102，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体。该铜绿假单胞菌噬菌体在水貂出血性肺炎预防中的应用，假设每只水貂的生活空间为1m3；采用超声喷雾方式：铜绿假单胞菌噬菌体的效价为109PFU/ml，每只水貂用量为10ml；在疾病暴发期每1个月施用1次，即可预防水貂出血性肺炎。采用超声喷雾的施用方式，噬菌体可直接到达致病菌定植的肺部，提高噬菌体控制动物肺部细菌性感染的效率，提高养殖经济效益。
【专利说明】一种铜绿假单胞菌噬菌体及其在水貂出血性肺炎预防中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一株能够特异性裂解铜绿假单胞菌菌株的噬菌体分离物及采用超声喷雾方式施用该噬菌体在水貂出血性肺炎预防中的应用。
【背景技术】
[0002]水貂是全球主要的毛皮经济动物养殖品种，具有较高的经济价值。近年来，我国对裘皮的需求日益增加，已从原来的裘皮出口国转化为主要裘皮进口及消费大国。国内裘皮市场的巨大发展潜力，也使得支撑裘皮工业发展的毛皮动物养殖业迅速发展。铜绿假单胞菌是一种条件性致病菌，在夏秋交替季节，该菌引起的水貂出血性肺炎，死亡率高达70%左右，给水貂养殖业带来了巨大的经济损失。
[0003]噬菌体是一种可以感染 细菌，不侵染动物和植物细胞的病毒。裂解性噬菌体(以下简称噬菌体)在感染细菌后，能引起宿主细胞破裂，利用这一特性可以应用噬菌体控制细菌感染。上世纪70-80年代，细菌耐药性问题，特别是超级细菌的出现，有关噬菌体作为抗菌制剂的研究受到普遍关注。目前，在美国以及一些东欧国家，噬菌体已经成功应用于动物性食品生产过程中，并有一些产品上市，在控制动物细菌性疾病方面彰显优势。
[0004]吸入给药可以将药物直接送至肺部，是治疗肺部疾病较为简单有效的给药途径。肺部给药新剂型和制剂主要有定量吸入剂、喷雾剂、干粉吸入剂、微球和脂质体。其中，超声喷雾采用高振动强度和低通风水平能有效地将药物送入肺深部，所需设备简单、制备费用较低等原因，是动物生产过程中治疗细菌肺部感染的最适给药方式。
[0005]本发明中的噬菌体分离物是从自然界分离得到裂解性噬菌体，对铜绿假单胞菌有较强的裂解作用；采用喷雾方式施用后，能够预防水貂出血性肺炎。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种应用裂解性噬菌体，采用超声喷雾的施用方式，降低出血性肺炎引起的死亡率，提高水貂养殖企业经济效益的技术方法。
[0007]技术方案
[0008]本发明提供了一种采用超声喷雾方式施用裂解性噬菌体，预防水貂养殖过程中由铜绿假单胞菌引起的出血性肺炎，降低由该病引起的死亡率，可提高水貂养殖企业经济效益的技术方法。
[0009]本发明的技术方案是提供了一种铜绿假单胞菌卩遼菌体Pseudomonas aeruginosabacteriophage,该卩遼菌体于2014年4月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.9102，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101。该噬菌体属短尾噬菌体科，头部直径约为40nm，头部长约为5nm。采用超声喷雾方式施用该铜绿假单胞菌噬菌体裂解液，对水貂出血性肺炎有较好的预防效果。[0010]本发明中以水貂来源的铜绿假单胞菌为宿主，分离得到I株铜绿假单胞菌强裂解性噬菌体，一步生长曲线表明，其潜伏期、裂解期分别约为25min、35min，裂解量为115PFU/感染细胞，裂解能力较强；对15株铜绿假单胞菌中的14个菌株有裂解作用，有较宽的裂解谱；经滴鼻的方式，接种噬菌体裂解液，与对照组相比，小鼠行为未出现异常，肺部、肝脏、脾脏均未出现病理变化，表明铜绿假单胞菌裂解性噬菌体裂解液安全、无毒副作用；使用超声喷雾雾化该噬菌体，对噬菌体的效价无显著影响；采用超声喷雾方式:铜绿假单胞菌噬菌体的效价为> 109PFU/ml，每只水貂的密闭空间为lm3，用量为IOml ;在疾病暴发期每I个月施用I次，即可预防水貂出血性肺炎。
[0011]本发明的有益效果:
[0012](1)分离获得一株铜绿假单胞菌强裂解性噬菌体，且裂解谱较宽，可应用于体内外控制铜绿假单胞菌感染；
[0013](2)采用超声喷雾的施用方式，噬菌体可直接到达致病菌定植的肺部，提高噬菌体控制动物肺部细菌性感染的效率，提高养殖经济效益；
[0014](3)应用该噬菌体控制铜绿假单胞菌，替代抗生素防治动物肺部细菌感染，可减少抗生素在水貂养殖过程中的使用量，降低耐药菌株的出现几率，提高抗生素治疗其他疾病的作用效果，降低饲养成本。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016]曬菌体的筛选和纯化
[0017]1.铜绿假单胞菌的制备
[0018]采集水貂养殖场患出血性肺炎的水貂病料，使用选择性培养基分离铜绿假单胞菌。采用分子生物学方法，确定该致病菌为铜绿假单胞菌。使用LB培养基扩增，留分离噬菌体用。
[0019]2.水样的处理
[0020]取医院废水，加入CaClJ*浓度为lmol/L，5000rpm离心10min，去除污水中的沉淀颗粒。取上清用0.22 μ m滤膜滤过除菌。取滤液20ml，与20ml2 X LB培养基混合，按1%的接种量，接种400 μ I的铜绿假单胞菌，37°C富集培养12h。取5ml的上述菌液，4°C，5000rpm离心10min，取上清用0.22 μ m滤膜滤过除菌，即得噬菌体原液。
[0021]3.噬菌体的分离
[0022]采用双层琼脂平板法，分离噬菌体，具体方法如下:将噬菌体原液，10倍梯度稀释，分别取300ul稀释液与300ul相应的对数期铜绿假单胞菌混合，37°C孵育15min，与5ml55°C保温的完全熔化顶层琼脂(琼脂浓度为0.5% )混合，均匀铺在下层琼脂(琼脂浓度1.5%)平皿上，冷却15min后倒置37°C过夜培养。次日，观察噬菌斑的出现情况。挑取单个噬菌斑，重复3次双层琼脂平板实验，得到单一的噬菌体。在挑取单个噬菌斑溶解Iml的生理盐水中。
[0023]4.噬菌体的扩增
[0024]挑铜绿假单胞菌单个菌落，接种于50ml液体LB培养基中，37 °C、140rpm振荡培养至对数生长期早期；加入1ml含有噬菌斑的生理盐水，37°C、160rpm振荡培养过夜；4°C、5000rpm离心10min,去菌体沉淀,取上清。加入到500ml的铜绿假单胞菌对数期菌液中，待菌液澄清后，4°C、5000rpm离心10min，取上清。反复扩增，使用0.22 μ m滤膜过滤，得到所要体积的噬菌体裂解液。
[0025]5.噬菌体的纯化
[0026]向噬菌体裂解液中加入NaCl，终浓度为lmol/L，冰浴Ih后，4°C、8000rpm离心lOmin，沉淀菌体碎片，收集上清；根据上清的体积，加入PEG，终浓度为10% (m/v)，4°C、1000Og离心10min，去上清，用等体积生理盐水溶解沉淀的噬菌体，即得到初步纯化的噬菌体裂解液。
[0027]实施例2
[0028]噬菌体的生物学特性
[0029]1.噬菌体的电镜观察
[0030]取超速离心提纯的噬菌体悬液滴于覆有聚乙烯甲醛膜的铜网上少许，以2%磷钨酸(pH7.0)染色5-10min，将铜网放于干燥滤纸上，自然干燥。然后用日立JEM2100C型电镜观察。
[0031]2.噬菌体的一步 生长曲线
[0032]加入噬菌体及对数早期的宿主菌使MOI = 0.1，37°C孵育15min后，1000OXg离心lOmin，弃上清，LB培养基悬浮菌体，再次离心、悬浮沉淀，洗涤2次后，用5ml预热的LB培养基混悬沉淀并充分混匀，迅速置于37°C摇床(140rpm/min)中培养，开始计时，于O时刻和每个IOmin取样100 μ 1，10000 Xg离心5min，吸取上清，10倍梯度稀释测定噬菌体滴度。各时间点均作双份复管取平均值，同时以不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体为对照，实验重复3次。最后以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标绘制一步生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期和裂解量。其中裂解量计算公式:裂解量=爆发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。
[0033]3.噬菌体的裂解谱
[0034]取300μ I的纯化后10倍梯度稀释的噬菌体溶液，分别与300ul新分离得到的15株待测的铜绿假单胞菌混合，37°C孵育15min后，加入5ml、55°C保温的已完全熔化的顶层琼脂混匀，迅速倾注在底层琼脂的LB培养皿上。冷却20min后，倒置37°C培养箱培养10-12h后，观察噬菌斑的出现情况。根据噬菌斑的出现与否，分别判断噬菌体的裂解谱。
[0035]实施例3
[0036]噬菌体的安全性实验
[0037]选择12只体重为25~30g的雄性昆明小鼠，随机分为实验组和空白对照组，分别鼻腔接种纯化的噬菌体裂解液(IOkiPFUAiI)和生理盐水20ul，连续接种3天后，观察小鼠的行为表现，并去肺、肝、肾做病理切片，确定纯化的噬菌体裂解液是否对小鼠有毒副作用。
[0038]实施例4
[0039]超声喷雾对曬菌体效价无显著影响
[0040]根据超声雾化器说明，雾化纯化的噬菌体裂解液，收集雾化后的噬菌体液滴，测定其效价，比较雾化前后噬菌体效价的变化。
[0041]实施例5
[0042]采用超声喷雾方式施用铜绿假单胞菌噬菌体预防水貂出血性肺炎实验I[0043]在出血性肺炎爆发高峰期间(8月-11月)，即8、9、10、11月的每月月初，使用超声雾化器以超声雾化方式，施用噬菌体裂解液预防水貂出血性肺炎。
[0044]试验时间:2012年8月I日；9月I日；10月I日；11月I日；
[0045]材料与方法:辽宁省某大型水貂养殖场，选取美国黑貂54只，随机分成两组，每组27只，各置入2个密闭空间内(均为27m3)。以PPA-ABTNL (效价为109PFU/ml)噬菌体裂解液270ml作为吸入液，使用雾化器在50min内将吸入液全部雾化，雾化后让水貂吸入lh。对照物吸入液为270ml的纯净水，雾化条件同上。每月初连续进行4次实验，详细记录水貂死亡情况，对疑似出血性肺炎的死亡病貂进行剖检，计算由出血性肺炎引起的死亡率。
[0046]表1超声雾化噬菌体混合制剂对水貂出血性肺炎死亡率的影响
【权利要求】
1.一种铜绿假单胞菌噬菌体，其特征在于，该铜绿假单胞菌噬菌体于2014年4月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.9102，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体。
2.—种铜绿假单胞菌噬菌体在水貂出血性肺炎预防中的应用，其特征在于，采用超声喷雾方式:铜绿假单胞菌噬菌体的效价为> 109PFU/ml，每只水貂的密闭空间为lm3，用量为10ml ;在疾病暴发期每I个月施用I次，即可预防水貂出血性肺炎。
【文档编号】A61P31/04GK103981154SQ201410235510
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】徐永平, 曹振辉, 张建城, 李振, 李晓宇, 王丽丽, 李纪彬, 李淑英, 徐乐 申请人:大连理工大学