专利名称：：绿脓杆菌的外膜蛋白pa5158的制作方法
技术领域：
：本发明涉及衍生自绿脓杆菌外膜蛋白PA5158的蛋白质抗原或肽抗原和针对该抗原的抗体。本发明也涉及包含该抗原的疫苗组合物。本发明还涉及包含所述抗体的药物组合物、用于绿脓杆菌感染的诊断剂、用于检测绿脓杆菌的试剂盒和增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效剂。
背景技术：
：绿脓杆菌(铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa))是广泛分布于自然环境例如土壤和水中的革兰氏阴性杆菌，引起抵抗治疗的严重致命感染。绿脓杆菌的主要感染对象是宿主防御功能减弱的缺乏抵抗力的患者，通常称作易感染性宿主，包括烧伤、器官移植和癌症患者。绿脓杆菌是院内感染的主要病原菌。此外，由这种细菌引起的肺部感染对嚢性纤维化患者是致命的。对这些患者主要施用具有抗绿脓杆菌活性的抗菌剂，而众多病例则因绿脓杆菌耐药性而未能获得充分的治疗效果。另外，也已经长时间地研究针对绿脓杆菌的疫苗或抗体。然而，直接使用该细菌灭活形式的方法具有缺点，即必须根据绿脓杆菌的不同血清型制备不同类型的疫苗或抗体。在这种情况下，期待利用具有绿脓杆菌菌林间共同氨基酸序列的绿脓杆菌蛋白被动免疫或主动免疫来预防或治疗绿脓杆菌感染。例如，已知其中外膜蛋白OprF和Oprl的部分相互融合的重组蛋白(日本特开第245699/1996号公才艮)和IV型菌毛蛋白(WO2004/099250)作为此种绿脓杆菌蛋白应用于疫苗的情形。另外，已经才艮道抗IV型菌毛抗体(W02004/099250)、抗PA1706(或PcrV)抗体(美国专利号6309561和6827935)等作为靶向绿脓杆菌蛋白的抗体药物。然而，在显示多样血清型的绿脓杆菌临床分离林间共同拥有的细菌蛋白可以作为"共同抗原，，应用于预防、诊断或治疗绿脓杆菌感染，并且因此一直是需要的。已经报道由PAS158(或opmG)基因编码的PA5158(也称作OpmG)蛋白是构成直接参与氨基糖苷类抗生素耐药性的流出泵的外膜蛋白(AntimicrobialAgentsandChemotherapy,2003，47，1101-1111)。然而，该蛋白质用作疫苗成分和针对该蛋白质的抗体用作绿脓杆菌感染的治疗剂或诊断剂是完全未知的。发明简述本发明人已经尝试从绿脓杆菌外膜蛋白中鉴定新和有用的"共同抗原"。在多次研究后，本发明人已经通过基因芯片分析发现编码存在于绿脓杆菌外膜中的PA5158(也称作OpmG)蛋白的基因稳定地表达，无论人血清存在或不存在(实施例1)。另外，本发明人已经通过对88林绿脓杆菌临床分离株的基因分析发现PA5158蛋白的2个推定胞外区不存在可检测的氨基酸突变并且完全是保守的(实施例2)。此外，本发明人已经证实用PA5158重组蛋白免疫获得的抗血清或抗体在绿脓杆菌感染的才莫型小鼠上显示强效的抗感染保护作用(实施例9-12)，该抗体与PA5158蛋白结合(实施例7、8和13)并且该抗体显示增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的作用(实施例14)。本发明基于这些发现。本发明的目的是提供用作疫苗组合物的蛋白质抗原或肽抗原，其中所述疫苗组合物具有实质的预防或治疗绿脓杆菌感染的能力并且可以对源自绿脓杆菌感染患者的多种临床分离林反应，或是提供针对所述抗原的抗体。根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA5158蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。根据本发明，提供了选自下列的蛋白质(本文中此后称作"本发明的蛋白质")(i)包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基*列的多核普酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基^列组成的蛋白质功能等同；和(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同.根据本发明，提供了包含序列编号5的氨基酸序列或含有一个至数个保守性替换的序列编号5的氨基酸序列的肽(本文中此后称作"本发明第一实施方案的肽")。根据本发明，提供了包含序列编号6的氨基酸序列或含有一个至数个保守性替换的序列编号6的氨基酸序列的肽(本文中此后称作"本发明第二实施方案的肽，，)(本文中此后有时将本发明第一实施方案的肽和本发明第二实施方案的肽统称为"本发明的肽")。根据本发明，提供了包含本发明的蛋白质或本发明肽的抗原组合物(本文中此后将这种抗原组合物和包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA5158蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物统称为"本发明的抗原组合物")。根据本发明，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，包含本发明的抗原组合物和任选地一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。根据本发明，提供了针对绿脓杆菌PA5158蛋白或其部分的抗体，或其功能性片段(本文中此后称作"本发明的抗体")。根据本发明，提供了在保藏号FERMBP-10672下保藏的杂交瘤。根据本发明，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，包含本发明第一实施方案的抗体和任选地一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。根据本发明，提供了用于绿脓杆菌感染的诊断剂，包含本发明第一至第三实施方案的任一抗体。根据本发明，提供了用于检测绿脓杆菌的试剂盒，包含本发明第一至第三实施方案的任一抗体。根据本发明，提供了增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效剂，包含本发明第一至第三实施方案的任一抗体。本发明提供具有实质的预防或治疗绿脓杆菌感染的能力并且还对源自绿脓杆菌感染患者的多种临床分离林反应的疫苗组合物和多克隆抗体或单克隆抗体。它们可以应用于绿脓杆菌感染的预防剂或治疗剂或用于绿脓杆菌感染的诊断剂。此外，本发明的抗体与在绿脓杆菌外膜中或在绿脓杆菌胞外存在的PA5158蛋白的胞外区结合。此外，据估计这些区域是在菌林间极端高度保守的，与血清型等无关，并且与多种临床分离林反应。因此，本发明的抗体预期对绿脓杆菌感染具有高的治疗效果。附图简述图l显示pET15b质粒(pET-PA5158國l)。发明详述PA5158蛋白PA5158蛋白是衍生自绿脓杆菌的外膜PA5158蛋白。该蛋白质的氨基酸序列和编码该蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列分别在序列编号3和序列编号1中描述。在本上下文中，基于信号序列和有关与PA5158蛋白高度同源的绿脓杆菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的立体结构信息、有关大肠杆菌(E.coli)TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立体结构信息和有关PA5158蛋白的二级结构信息，估计在作为核苷酸序列序列编号1的氨基酸编码区的1479个核苷酸中第337位至1479位核苷酸的核苷酸序列编码PA5158蛋白的细胞表面暴露部分(序列编号2)。PA5158蛋白的细胞表面暴露部分是选自下列的蛋白质(i)包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基^列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。在本说明书中，表述"缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸"意指已经根据熟知技术方法例如位点定向诱变或通过替换多个氨基酸至天然产生的程度实施了修饰。待修饰氨基酸的数目可以优选地是l-50个、更优选是l-30个，仍更优选是1-10个，仍就更优选是1-5个并且最优选地是1个或2个。修饰的氨基酸序列可以优选地是其氨基酸序列中具有一个或多个(优选地，一个至几个或l、2、3或4个)保守性替换的氨基酸序列。在本说明书中，术语"保守性替换"意指一个或多个氨基酸残基用化学相似的其它氨基酸残基替换。此类保守性替换的实例包括其中某个疏水性残基用另一个疏水性残基替换的情况，和其中某个极性残基用带相同电荷的另一个极性残基替换的情况。对于每种类型的氨基酸，可以按照如此方式进行替换的功能相似氨基酸是本
技术领域：
已知的。非极性(疏水性)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。正电荷(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。负电荷(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。在本说明书中，术语"在严格条件下"意指其中杂交后的膜洗涤过程在高温度于具有低盐浓度的溶液中实施的条件。此类洗涤条件可以例如是在60。C的0.5xSSC(lxSSC:15mM柠檬酸三钠和150mM氯化钠)持续15分钟，并且优选地是在60。C的0.5xSSC，0.1%SDS持续15分钟。可以4艮据已知方法实施杂交。在使用商业可获得文库的情况下，可以根据随该文库所包括说明书中描述的方法实施杂交。在本说明书中，术语"同一性"就核苷酸序列或氨基^列而言，意指度。在本说明书中所述的这种同一性的数值可以使用本领域技术人员已知的同源性检索程序进行计算。例如，这种数值如同一性可以容易地使用FASTA或BLAST中的默认(初始设定)参数进行计算。与序列编号4的氨基酸序列具有70。/。或更大同一性的氨基酸序列可以与前述氨基酸序列具有优选80%或更大、更优选85%或更大、仍更优选卯％或更大、仍就更优选95%或更大、特别优选98%或更大和最优选99%或更大同一性的氨基酸序列。在本发明中，若给出了序列编号4的氨基酸序列，则可以容易地确定编码该氨基酸序列的核苷酸序列。因此，可以选择编码序列编号4的氨基酸序列的多种核苷酸序列。因此，编码包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸不仅意指序列编号2的完整DNA序列的部分，还意指编码相同氨基酸的DNA序列，其具有简并关系中密码子作为DNA序列的序列。本发明还包括与此种DNA序列相对应的RNA序列。编码包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的优选实例包括包含序列编号2的核苷酸序列的多核苷酸。在本说明书中，某种蛋白质是否与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同可以通过评估生物学现象或功能而确定，其中所述的生物学现象或功能与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质的表达相关。例如，这可以通过遗传重组才支术使这种蛋白质表达并随后评估是否可以制备抗PA5158蛋白的抗体而确定。因为本发明的蛋白质暴露在绿脓杆菌的细胞表面上，因而该蛋白质可以用作制备抗绿脓杆菌抗体的抗原(蛋白质抗原)使用。在PA5158蛋白的细胞表面暴露部分中，鉴定了不存在可检测的氨基酸突变的以下两个部分(本文中此后称作推定胞外区)包含序列编号5的氨基酸序列的肽，或包含含有一个至数个保守性替换的序列编号5的氨基酸序列的肽；和包含序列编号6的氨基酸序列的肽，或包含含有一个至数个保守性替换的序列编号6的氨基酸序列的肽。因为本发明的肽暴露在绿脓杆菌的细胞表面上并且在绿脓杆菌中保守，因而该肽可以用作制备抗绿脓杆菌抗体的抗原(肽抗原)。已经证实该肽在众多的绿脓杆菌临床分离林中不存在可检测的氨基酸突变并且因此有利的之处就在于它们用作共同抗原。对于本发明的肽而言，可以将封闭基团例如添加至肽的氨基末端或羧基末端以防止因电荷所致的聚集。常分别对氨基末端和狻基末端使用乙酰化和酰胺化，但不限于这些。本发明的肽可以例如通过对其添加半胱氨酸残基而修饰以增强与间隔物的结合。磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基曱基环己烷-l-羧酸酯)等通常用作间隔物，但不限于此。可以使用起到间隔物作用的化合物。对于本发明的肽，载体蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、或钥孔血蓝蛋白(KLH)可以用作载体，但不限于此。[抗原组合物J本发明的蛋白质或本发明的肽可以用作蛋白质抗原或肽抗原。因此，根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌外膜PA5158蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。在本上下文中，蛋白质抗原或肽抗原可以优选地通过根据本领域技术人员众所周知的方法纯化本发明的蛋白质或本发明肽而使用。在本说明书中，术语"抗原组合物，，可以是仅由蛋白质抗原或肽抗原组成的组合物或包含此类抗原和其它成分的组合物。根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA5158蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。疫苗组合物J本发明的抗原组合物可以用作疫苗。因此，根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌外膜PA5158蛋白抗体的抗原组合物的疫苗组合物。根据本发明，可以制备用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，包含本发明的抗原组合物和任选地一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或佐剂在本发明的疫苗組合物中使用的载体基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂进行选择，并且可以例如是载体蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH))、增溶剂(例如乙醇、聚山梨酸酯、CremophorELTM)、等渗剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂(例如乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、麦芽糖、磷酸氢钙、轻质无水硅酸和碳酸钩)、粘合剂(例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素和阿拉伯胶)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石和氩化油)和稳定剂(例如乳糖、甘露醇、麦芽糖、聚山梨酸酯、聚乙二醇、和聚氧乙烯氢化蓖麻油)。甘油、二甲基乙酰胺、70%乳酸钠、表面活性剂或碱性物质(例如氬氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、葡曱胺或三氨基甲烷)等可以根据需要添加。特別地，本发明的肽可以与作为栽体蛋白的已知KLH溶液(Calbiotec，每亳升50。/。甘油溶液溶解125mg)偶联，以增强本发明疫苗组合物的抗原性。在本发明疫苗组合物中使用的稀释剂基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂而选择。稀释剂的实例包括水、生理盐水、磷酸盐緩冲生理盐水和碳酸氢盐溶液。在本发明疫苗组合物中使用的佐剂基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂而选择。佐剂的实例包括霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、脂质体和免疫刺激性复合体(ISCOM)。施用途径可以根据具有绿脓杆菌感染风险的受者的年龄、体重、性别和总体健康而不同，但是施用可以通过经口施用和肠胃外施用(例如静脉内注射、动脉内注射和局部施用)的任一途径而实施。在它们当中，优选肠胃外施用。用于经口施用和肠胃外施用的剂型及其制备方法是本领域技术人员众所周知的。用于经口施用和肠胃外施用的剂型可以通过常规方法，例如通过将本发明的抗原组合物与例如前述可药用的载体混合而制备。用于经口施用的剂型实例包括固体和液体剂型如溶液剂、片剂、颗粒剂、散剂或胶嚢剂。用于肠胃外施用的剂型实例包括溶液剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、栓剂、眼药剂、滴鼻剂和滴耳剂。若需要本发明制剂的持续释放，则可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙交酯共乙交酯、或聚乙交酯)作为增容基质(见例如美国专利号5,417,986、4,675,381和4,450,150)。在经口施用的情况下，也可以添加香味剂和着色剂。合适的药物载体和稀释剂等以及为了使用它们所需的物质在Remington'sPharmaceuticalSciences中描述。本发明疫苗组合物的剂量由本发明人基于疫苗抗原的类型、本发明的抗原是否与佐剂组合施用、与本发明抗原共同施用的佐剂的类型、施用模式和频率以及希望的效果(例如预防或治疗效果)而确定，并且通常可以是每个成人1照/剂量-100mg/剂量。当本发明疫苗与佐剂一起施用时，剂量可以通常是每个成人lng/剂量-lmg/剂量。这种剂量可以根据根据本发明人的决定按照需要施用数次。例如，可以实施初始接种和间隔1周时间的后续3次加强接种。另外，加强注射和第二次加强注射可以使用相同制剂距离首次免疫第8至第12周以及第16至第20周分别实施。[抗体本发明的抗体可以识别绿脓杆菌外膜PA5158蛋白或其部分，并且与绿脓杆菌结合。根据本发明，提供了本发明的抗体或其功能性片段，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的部分是绿脓杆菌PA5158蛋白的细胞表面暴露部分。根据本发明，提供了本发明的抗体(本文中此后称作"本发明第一实施方案的抗体")，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的部分是本发明的蛋白质。根据本发明，提供了本发明的抗体(本文中此后称作"本发明第二实施方案的抗体")，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的部分是本发明第一实施方案的肽。根据本发明，提供了本发明的抗体(本文中此后称作"本发明第三实施方案的抗体")，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的部分是本发明第二实施方案的肽。此种抗体包括识别本发明的蛋白质并与绿脓杆菌结合的抗体。该抗体还包括识别本发明肽的抗体。的抗原组合物免疫实验动物而获得，其中所述的抗原组合物以可以诱导抗体的量施用。这种抗体可以通过从心脏或动脉收集血液、从中分离抗血清并纯化获得的抗血清而作为纯抗体使用。本发明的抗体包括使用PA5158蛋白或肽作为抗原并用所述抗原来免疫哺乳动物例如小鼠而获得的多克隆抗体或单克隆抗体(其包括由产生本发明单克隆抗体的杂交瘤所产生的单克隆抗体)；由遗传重组技术制备的嵌合抗体和人源化抗体；和使用产生人抗体的转基因动物等制备的人抗体。当本发明的抗体作为药物施用至人时，人抗体因减少的副作用而优选地使用。"人抗体，，意指其中全部区域衍生自人的抗体。本发明的人抗体可以使用本领域才支术人员众所周知的方法制备(见例如Intern.Rev.Immunol,1995，13，65-93;J.Mol.Biol,1991，222，581-597;日本特开第146194/1998号公报；日本特开第155492/1998号公报；日本专利号2938569;日本特开第206387/1999号公报；日本特表第509612/1"6号公报；和日本特表第505107/1999号公报)。"人源化抗体"是通过仅移植小鼠抗体的抗原结合位点(CDR;互补决定区)的基因序列至人抗体基因(CDR移植)而制备的抗体。本发明的人源化抗体可以^吏用本领域技术人员众所周知的方法(见例如EP239400和WO90/07861)制备。"嵌合抗体"是这样的抗体，其通过连接某种抗体的可变区至不同种抗体的恒定区而制备。具体地，小鼠用抗原免疫，并且与该抗原结合的抗体可变区(V区)从小鼠单克隆抗体的基因中被切下。随后使如此获得的V区连接至衍生自人骨髓的抗体恒定区(c区)基因，以制备嵌合抗体。本发明的嵌合抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法(见例如日本特开第280387/1996号^^才艮和美国专利号4816397，4816567和5807715)制备。本发明单克隆的抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法制备(见例如抗体实验手册(Antibodies:ALaboratoryManual)，编者Harlow和DavidLane,冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)(1988);单克隆抗体实验手册(ExperimentalManualforMonoclonalAntibody)，SakujiToyama等编辑，Kodansha(1987);和单克隆抗体杂交瘤和ELISA(MonoclonalAntibody:HybridomaandELISA)，TatsuoIwasaki等编辑，Kodansha(1987)).本发明的多克隆抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法制备。"功能性片段"才艮据本发明意指抗体的部分(部分片段)，其特异性地识别本发明的蛋白质。这种功能性片段的具体实例包括Fab、Fab，、F(ab，)2、可变区片段(Fv)、二硫键连接的Fv和单链抗体(scFv)及它们的聚合物。本发明第一实施方案的抗体的优选实例包括针对这样的蛋白质的抗体和其功能性片段，其中所述的蛋白质包含序列编号4的氨基酸序列或包含了含有一个至数个保守性替换的序列编号4的氨基酸序列。本发明第二实施方案的抗体的优选实例包括通过在FERMBP-BP-10672下l呆藏的杂交瘤产生的单克隆抗体。因此，根据本发明，提供了于2005年10月7日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(T305-8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)的保藏号为FERMBP-10672(自FERMP-20675移管)的杂交瘤(5158-L1-1)。本发明的抗体优选是单克隆抗体。根据本发明，提供了这样的单克隆抗体，其与本发明杂交瘤所产生的单克隆抗体所针对的同一抗原发生交叉反应。根据本发明，提供了可以与绿脓杆菌结合的抗体，其由动物自身免疫系统应答本发明的抗原组合物而产生。[抗体和药物组合物的用途与绿脓杆菌相关的疾病绿脓杆菌是因降低宿主抵抗力而造成致命后果的机会感染病原体。另外，绿脓杆菌耐受抗生素并且因此是医院内感染的主要病原菌。如稍后在实施例中显示，已经证实本发明第一实施方案的抗体在巨噬细胞功能因施用粘蛋白而降低的绿脓杆菌易感性鼠模型上和在中性白细胞水平因施用一水合环磷酰胺而降低的绿脓杆菌易感性鼠模型上确实具有抗感染保护作用(实施例9和10)。还证实本发明第一实施方案的抗体在多药耐药性绿脓杆菌易感性鼠模型上确实具有抗感染保护作用(实施例ll和l"。因此，本发明第一实施方案的抗体用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病。与绿脓杆菌相关的疾病的实例包括由绿脓杆菌感染包括多药耐药性绿脓杆菌感染引起的全身感性疾病，例如败血症、脑膜炎和心内膜炎。与绿脓杆菌相关的疾病的其它实例包括耳鼻喉学领域的中耳炎和鼻窦炎；肺脏学领域的肺炎、慢性呼吸道感染和气管感染；外科领域的术后腹膜炎和胆管术后感染等；眼科领域的眼睑脓肿、泪嚢炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎和眼眶感染、和泌尿外科学领域的泌尿道感染(包括复杂的泌尿道感染)、导管感染和肛周脓肿。其它实例包括烧伤(包括重度烧伤和呼吸道烧伤)、褥疮感染和嚢性纤维化。本发明第一实施方案的抗体是有用的，因为它预期有效地预防或治疗难以治疗的多药耐药性绿脓杆菌感染。根据本发明，提供了本发明第一实施方案的抗体的用途，用于产生针对与绿脓杆菌相关的疾病的预防剂或治疗剂。根据本发明，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的方法，包括施用预防性或治疗性有效量的本发明第一实施方案的抗体至哺乳动物(包括人)的步骤。用于绿脓杆菌感染的诊断剂如稍后在实施例中所示，已经证实本发明第一实施方案的抗体分别与本发明的蛋白质、本发明第一实施方案的肽、本发明第二实施方案的肽结合，并且仅与绿脓杆菌反应而不与其它细菌菌种反应(实施例7和8)。也证实本发明第二实施方案的抗体与本发明第一实施方案的肽结合(实施例13)。还证实本发明第三实施方案的抗体与本发明第二实施方案的肽结合，并且仅与绿脓杆菌反应而不与其它细菌菌种反应(实施例7)。因此，本发明的抗体用于诊断绿脓杆菌感染。本发明的抗体不但可以作为纯化产物使用，还可以杂交瘤培养上清液或腹水的形式使用，以区分绿脓杆菌感染与其它细菌菌种感染。根据本发明，提供了使用本发明抗体用于诊断绿脓杆菌感染的方法。本发明的诊断方法可以通过如此方式实施，即收集生物样本，例如来自哺乳动物(包括具有绿脓杆菌感染风险的人)的痰、肺洗出液、脓、泪、血液或尿，随后将收集的样品与本发明的抗体接触，以及确定是否发生抗原-抗体反应。用于绿脓杆菌感染的诊断药试剂盒根据本发明，提供了用于检测绿脓杆菌存在的试剂盒，其至少包含本发明的抗体。本发明的抗体可以被标记。该检测试剂盒通过检测抗原-抗体反应而检测绿脓杆菌的存在。因此，本发明的检测试剂盒还可以含有多种类型的用于实施抗原-抗体反应的试剂、所用的第二抗体(例如在ELISA中)、生色试剂、緩冲液、说明书和/或根据需要的仪器。用于增强氨14t苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效剂如稍后在实施例中所示，已经证实本发明抗体的添加增强氨基糖苷类抗生素庆大霉素的抗微生物活性(实施例14)。因此，本发明的抗体可以用作增强抗绿脓杆菌活性的增效剂。根据本发明，提供了本发明抗体用于产生增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效剂的用途。根据本发明，提供了用于增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的方法，包括施用治疗性有效量的本发明抗体至哺乳动物(包括人)的步骤。药物组合物本发明的药物组合物或药剂可以组合物的形式使用，其中所述的组合物包含本发明的抗体作为活性成分，优选地含有纯化的抗体和任选地含有其它成分，例如生理盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐緩沖液。本发明的药物组合物可以根据需要配制成液体或冷冻干燥的形式。此种药物组合物可以任选地含有可药用的载体，例如稳定剂、防腐剂和等渗剂。可药用载体的实例可以包括用于冷冻干燥制剂的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；和用于液体制剂的生理盐水、注射用水、磷酸盐緩沖液和氢氧化铝，但不限于这些实例。施用途径可以根据受者的年龄、体重、性别和总体健康而不同，但是施用可以通过经口施用和肠胃外施用(例如静脉内注射，动脉内注射和局部施用)途径而实施。在它们当中，优选肠胃外施用。药物组合物的剂量根据患者的年龄、体重、性别和总体健康、绿脓杆菌感染的严重性和待施用的抗体组合物的成分而不同。本发明抗体组合物的日剂量对于静脉内注射通常是0.1-1000mg/kg每个成人体重、优选地1-100mg/kg每个成人体重。优选本发明的药物组合物应当事先施用至具有绿脓杆菌感染风险的患者。当药物组合物制备为诊断剂时，这种诊断剂可以通过采用适合此目的的任意手段以任意剂型获得。例如测定腹水、含有目的抗体的培养液或经纯化抗体的抗体滴度并且以PBS(含有生理盐水的磷酸緩沖液)等适度地稀释，并且随后对其添加防腐剂例如0.1%叠氮钠。另夕卜，还测定吸附至乳胶等的本发明抗体的抗体滴度并且适度地稀释，并对其添加防腐剂以便使用。这种与乳胶粒子结合的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。在这种情况下，适宜的树脂材料例如聚苯乙烯、聚曱基苯乙烯或聚丁二烯是作为乳胶而适用的。实施例本文中此后，本发明将参考用于促进理解本发明的实施例而描述。然而，本发明将不限于这些实施例。实施例1:基因芯片分析使用基因芯片表达分析系统(Affymetrix，基因芯片绿脓杆菌基因组阵歹'J)作为用于鉴定在补充了人血清的培养基中所表达基因的方法。使用绿脓杆菌PA01林(ATCCBAA-47)在3种不同培养条件即在补充0%、20%和50%人血清的Luria-Bertani(LB)培养基(NacalaiTesque)(在它们中LB培养基的最终组成相同)中在37。C实施振荡培养直至吸光度在595nm处达到1.0。<吏用RNeasyProtectBacteriaMini试剂盒(QIAGENGmbH)，总RNA根据在该试剂盒所包括的文件中描述的方法提取并使用2100生物分析仪(AgilentTechnologies)定量(AgilentTechnologies)。随后，实验根据随基因芯片所包括文件中描述的方法进行。使用MicroarraySuite5.0(Affymetrix)分析基因表达数据，并且计算信号及检测。在此时，实施校正，使来自全部揮:针组的信号的平均值是1000。实施了两个独立的实验。作为结果，在全部培养条件下，无论添加的血清存在或不存在，将显示检测到转录产物确定为作为持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是"存在"的，并且因此证实该基因表达。另外，确定作为与PA5158和PA2019(MexX)蛋白结合以构成药物流出泵的内膜跨越蛋白并受到核糖体抑制剂例如四环素或氨基糖苷类抗生素诱导的PA2018蛋白(MexY)(J.Bacteriology,2005,187，5341-5346)在没有前述那些药物的这些条件下是，，不存在"的，并且因此证实该基因不表达。相反，在全部培养条件下，无论添加的血清存在或不存在，确定PA5158蛋白是"存在"的。因此，PA5158基因当然表达了，并且提出这样的可能，即PA5158基因产物PA5158蛋白稳定地在细菌表面上存在。这提示绿脓杆菌PA5158蛋白可用作疫苗成分。实施例2:分析临床分离抹中的PA5158基因所用的细菌菌林是88林绿脓杆菌菌株(贮藏于横滨研究实验室，MeijiSeikaKaisha)，分离自日本各地临床机构的多种类型临床材料并进行测试。这些菌林源自血液、尿、脓、咽粘液等，并且基于根据日本绿脓杆菌协会(1975)所赞助的血清分型委员会决定，进行血清学分类法，它们的血清型包括A、B、E、G、I等组。(1)基因組DNA的制备88林绿脓杆菌临床分离抹的每一林在37。C在Mueller-Hinton培养基(BectonDickinson)中培养过夜并通过低速离心而收集。使用DNeasy组织试剂盒(QIAGENGmbH),根据随该试剂盒所包括的文件中描述的方法，从获得的细菌细胞中制备基因组DNA。(2)通过PCR方法扩增DNA片段使用制备的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增了含有PA5158基因的区域。具体而言，用于特异性扩增每一基因的引物组(序列编号7和序列编号8)基于绿脓杆菌PAOl基因组的序列(NCBI登录号NCJ)02516)设计。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)，根据其中所包括的说明书，使用TakaraExTaq(TakaraBio)实施PCR。如此由PCR扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳证实具有目的大小(1645bp)。(3)使用DNA测序仪分析多核苷^列PCR产物4吏用MultiScreenPCR板(MilliporeCorporation)纯化并且随后进行测序反应。能够对每种PCR产物测序的引物(序列编号9至序列编号12)基于PAOl基因组序列(NCJ)02516)设计。在测序反应中使用BigDyeTerminatorvl.l循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)才艮据其中所包括的说明书实施测序反应。使用事先以水溶胀的SephadexG-50FineDNAGrade(AmershamBiosciencesAB)所填充的MultiScreen-HV板(MilliporeCorporation)纯化测序反应产物。随后，使用AppliedBiosystems3730DNA分析仪(AppliedBiosystems)分析多核苷#列。将临床分离林中通过所述分析而测定的多核苷酸序列转换成多肽序列，并且这些多肽序列与来自PAOl菌抹的多肽序列进行比较。作为结果，在PA5158蛋白的全长序列中观察到21处突变(表1)。不过，2个推定胞外区(序列编号5和序列编号6)证实不存在可检测的氨基酸突变，其中所述的推定胞外区由本发明人基于有关与PA5158蛋白高度同源的绿脓杆菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem"2004,279，52816-52819)的立体结构信息、有关大肠杆菌TolC蛋白(Nature，2000，405,914-919)的立体结构信息和有关PA5158蛋白的二级结构信息而预测。这提示绿脓杆菌PA5158蛋白可用作"共同抗原"。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例3:PA5158基因DNA片段的克隆在作为绿脓杆菌PA5158基因(序列编号l)的氨基酸编码区的1479个核苷酸中第337位至1479位核苷酸的DNA片段(序列编号2)通过以下方法掺入无细胞的蛋白质表达载体pIVEX2.4d(RocheDiagonstics)和大肠杆菌表达载体pET15b(Novagen)。基于信号序列和有关与PA5158蛋白高度同源的绿脓杆菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的立体结构信息、有关大肠杆菌(E.coli)TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立体结构信息和有关PA5158蛋白的二级结构信息，估计在所述氨基酸编码区中第1至336位核苷酸的核普酸序列编码细胞表面非暴露区域，因此，该段核普酸序列从克隆中排除。待克隆的DNA片段从绿脓杆菌PAOl基因组DNA中通过PCR(GeneAmpPCRSystem9600;Perkin-Elmer)扩增。寸吏用Pyrobest(TakaraBio)作为DNA聚合酶。反应溶液补充以10%二甲基亚砜。含有用于添加限制性位点XhoI(CTCGAG)和BamHI(GGATCC)的核苷酸的引物(序列编号13和序列编号14)用作PCR引物。温度条件包括在94。C加热2分钟，随后是由94'C-30秒，54°C-1分钟和72。C-2分钟构成的30次循环，和在72。C额外5分钟的终末反应。PCR产物使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)加以纯化，并且纯化产物用XhoI(NewEnglandBiolabs)和BamHI(Toyobo)消化。pIVEX2.4d用Xhol和BamHI消化。这些DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取和纯化。使用T4DNA连接酶(LigationHigh,Toyobo)连接以XhoI-BamHI消化的PCR产物和pIVEX2.4d，并且大肠杆菌DH5a菌林(高感受态DH5a，Toyobo)以连接产物转化。使用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen)纯化其中已经掺入PA5158基因片段的pIVEX2.4d质粒(pIVEX-PA5158-10),并且证实插入物的核苷酸序列(BigDyeTerminatorvl.l循环测序试剂盒，AppliedBiosystems)。接下来，pET15b用Xhol和BamHI消化并且与pIVEX-PA5158-10的XhoI-BamHI插入片段连接。用连接产物转化大肠杆菌，获得其中已经掺入PA5158基因片段的pET15b质粒(pET-PA5158-l)(图1)。实施例4:PA5158重组蛋白的表达和纯化在重组蛋白的表达中使用无细胞和大肠杆菌表达系统。在无细胞系统中使用了利用T7RNA聚合酶和大肠杆菌裂解物而实施转录和翻译的RTS500ProteoMaster大肠杆菌HY试剂盒(RocheDiagonstic)。无细胞的蛋白质表达载体pIVEX-PA5158-10是编码其中His标签(6个连续组氨酸)融合在T7启动子下游的PA5158蛋白的质粒(见实施例3)。无细胞反应溶液根据说明书制备。反应通过添加lOjigpIVEX-PA5158-10在30'C实施20小时，并且通过离心收集所产生的不溶性蛋白质。在大肠杆菌表达系统中使用其中已经掺入T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌林和具有T7启动子的pET载体表达系统(Novagen)。在该表达系统中，在BL21(DE3)菌抹染色体中掺入的T7RNA聚合酶基因的转录受lacl阻抑蛋白抑制，并且这种转录抑制通过添加诱导物异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)解除以诱导T7RNA聚合酶的表达。另外，掺入pET载体中T7启动子下游的基因的转录也受lacl阻抑蛋白抑制，并且这种转录抑制通过添加IPTG解除，以通过转录而诱导掺入基因的表达，其中所述的转录由从宿主中提供的T7RNA聚合酶引起。大肠杆菌表达载体pFT-PA5158-l是编码其中组氨酸标签已经在T7启动子下游融合的PA5158蛋白的质粒(见实施例3)。BL21(DE3)菌林用氯化钙处理(见MolecularCloning,第二版，Sambrook等(1989))并以pET-PA5158-l转化。转化体在含有50jig/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，并且将它们在新鲜培养基中悬浮(200倍稀释)并在37。C培养4小时。随后添加IPTG至终浓度0.5mM，并且培养继续进行额外的3小时。细胞通过离心收集并在-20。C冷冻。细胞在BugBuster蛋白质提取试剂(Novagen)中溶解，并且包涵体根据包含的说明书进行收集。在该方法中，还实施超声破碎，并且使用终浓度200jig/mL的溶菌酶(卵清溶菌酶，SeikagakuCorporation)。在蛋白质纯化中使用了利用His-标签的Ni螯合层析。在无细胞或大肠杆菌表达系统中表达的不溶性蛋白质用溶解緩冲液(补充有8M尿素、5mM咪唑、200mMNaCl和0.1。/。NP-40的Dulbecco磷酸盐緩冲的生理盐水(PBS))溶解。溶解的蛋白质结合至Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)并用40体积的溶解緩冲液洗涤。蛋白质进一步用40体积的洗涤緩沖液(除NP-40外，具有如溶解緩沖液那样的相同组成)洗涤。随后，His-标签-融合蛋白用洗脱緩冲液(补充有8M尿素、300mM咪唑和200mMNaCl的PBS)洗脱，随后收集。作为结果，最终从无细胞系统的1ml反应溶液和大肠杆菌表达系统的100ml培养物中分别获得1.5mg蛋白质和9.0mg蛋白质。实施例5:用抗原免疫和制备血清绿脓杆菌PA103菌林(ATCC29260)在37。C在Mueller-Hinton琼脂培养基上培养过夜。将几个菌落在LB培养基中悬浮并且随后在"。C振荡培养过夜，并将它们用PBS洗涤，随后重悬。随后，通过添加1%福尔马林进行灭活处理24小时或更长时间，并且使用如此灭活的菌林。为在免疫中使用，将PA5158重组蛋白溶解在8M尿素溶液中，产生100ng/ml的浓度。PA5158蛋白胞外区的氨基i^列由本发明人基于有关与PA5158蛋白高度同源的绿脓杆菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem"2004，279，52816-52819)的立体结构信息、有关大肠杆菌TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立体结构信息和有关PA5158蛋白的二级结构信息而估计。含有所估计氨基酸序列(序列编号5和序列编号6)的肽通过使用Fmoc的固相合成法合成。将半胱氨酸残基添加至序列编号5和序列编号6的每个氨基酸序列的氨基末端。合成了具有乙酰化氨基末端和酰胺化羧基末端的肽。通过质谱在含有序列编号5的氨基酸序列的合成肽(序列编号15)中观察到[M+llm/z1664.2(计算值m/z1663.9)，并且由HPLC分析对这种合成肽给出在l5.469分钟保留时间处具有面积比88.25%的峰。另外，通过质语在含有序列编号6的氨基酸序列的合成肽(序列编号16)中观察到[M+1m/z1540.6(计算值m/z1538.7)，并且由HPLC分析对这种合成肽给出在12.524分钟保留时间处具有面积比76.47%的峰。合成肽通过间隔物与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，以制备缀合的肽。磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-l-羧酸酯；Pierce)用作间隔物。委托ThermoELECTRON进行肽的合成和KLH-缀合肽的制备。为在免疫中使用，将KLH-缀合的肽溶解在8M尿素溶液中，产生lOOjig/ml的浓度。在免疫方法中，雄性BN大鼠(从日本CharlesRiver实验室购买)或雌性新西兰白兔(从日本CharlesRiver实验室购买)以总计6次注射进行皮下或肌内免疫，首次注射联合使用弗氏完全佐剂并且后续注射联合使用不完全佐剂，间隔时间2周。对于这样的免疫，每只动物分别使用20jig的福尔马林灭活菌林、PA5158重组蛋白和实施例5中所述的KLH-缀合肽。最后一次免疫l周后，从腹主动脉或颈动脉收集全血，并且全血在室温下搁置1小时并在1500G离心20分钟，以获得具有约5ml/大鼠血清或50ml/兔血清的上清液。实施例6:从抗血清中纯化IgG级分才艮才居例长口McCauleyR&Racker，F;MolecularandCellularBiochemistry1，73-81(1973)的方法从大鼠抗血清和兔抗血清中纯化IgG级分。添加冰冷的饱和硫酸铵溶液(pH8)以制备43(v/v)。/。混悬液，并且获得的混悬液在室温搅拌15分钟。沉淀物通过在10，000xg离心20分钟而收集并且在补充有10%甘油的10mM磷酸钾緩沖液(pH8)中溶解。随后，沉淀物通过添加》K冷的饱和石克酸铵溶液(pH8)以制备50(v/v)V。溶液而再次沉积，从而完成2次洗涤。沉淀物在补充有10%甘油的10mM磷酸钾緩冲液(pH8)中溶解，并且随后对该緩冲液透析过夜。将透析液离心并且随后进行阴离子交换层析(DEAE-Toyopearl650M(Tosoh))。将流过的体积通过测定在280nm的紫外吸收而作为IgG级分收集。收集的级分使用AmicoiiUltra-15(MiUipore)予以浓缩，并且緩冲液最终与PBS(-)溶液交换，以获得最终样品。3.0-8.0mg和30-50mg蛋白质作为IgG级分分别从3ml大鼠抗血清和15ml兔抗血清中通过纯化获得。蛋白质根据基于Lowry法的DC蛋白质测试法(Bio-Rad)定量，并且通过SDS-PAGE评估IgG纯度。作为备选方法，在从兔抗血清纯化IgG级分时使用蛋白G亲和柱层析。该方法根据随HiTrap蛋白GHP(Amersham)所包括的说明书实施。将兔抗血清添加至用20mM磷酸钠緩沖液(pH7)平衡的HiTrap蛋白GHP柱，并且该柱用相同的緩沖液洗涤。使用0.1M甘氨酸-HCI緩冲液(pH2.7)实施洗脱，并且洗脱液立即用事先放置在分步收集管内1/20体积的1.0Mtris-HCl緩沖液(pH9)中和。待收集的体积通过测定在280nm的紫外吸收而确定。收集的级分使用AmiconUltra-15(Millipore)予以浓缩，并且緩沖液最终与PBS(-)溶液交换，以获得最终样品。从10ml兔抗血清中通过纯化获得作为IgG级分的60mg蛋白质。蛋白质根据基于Lowry法的DC蛋白质测试法(Bio-Rad)定量，并且通过SDS-PAGE评估IgG纯度。实施例7:完整细胞ELISA(wholecellELISA)试验对于完整细胞ELISA,在LB培养基中培养的PA103菌林的细菌混悬液分配至ELISA板(MaxiSorpType,NUNC),随后在4°C固定。该板随后用含有0.05%吐温20的TBS洗涤并以含有2%牛血清白蛋白和0.05%吐温20的TBS封闭。此后，血清或在实施例5中获得的纯化IgG级分以生理盐水稀释并且作为第一抗体样品添加至板，并且使该样品与所述菌林在37。C反应1小时。洗涤后，4吏用过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体(5000倍稀释，Sigma)或过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(5000倍稀释，Sigma)作为第二抗体，并且酶反应通过添加显色底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统，KPL)而实施并且随后用0.18M疏酸终止。测定在450nm处的吸光度。作为结果，就PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清而言，免疫前阴性对照大鼠血清(100倍稀释)的吸光度是0.031，而PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清(IOO倍稀释)的吸光度是0.399。这表明在PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中含有识别细菌细胞表面暴露的PA5158蛋白胞外区的抗体(IgG)。另外，就从PA5158重组蛋白免疫的兔血清中所获得纯化的IgG级分而言，从阴性对照兔假血清中纯化的IgG级分(5照/ml)的吸光度是0.15，而从PA5158重组蛋白免疫的兔血清中纯化的IgG级分(5jig/ml)的吸光度是0.9卯。这表明源自PA5158重组蛋白免疫的兔血清的IgG级分中含有识别细胞表面暴露的PA5158蛋白胞外区的抗体(IgG)。此外，就从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中所获得纯化的IgG级分而言，从作为阴性对照的假手术大鼠血清中纯化的IgG级分(50pg/ml)的吸光度是0.132,而从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化的IgG级分(50ng/ml)的吸光度是0.370。另外，用KLH-缀合的序列编号16的肽免疫的大鼠血清中纯化的IgG级分(50jig/ml)的吸光度是0.322。这表明源自PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清和KLH-缀合肽免疫的大鼠血清的IgG级分含有识别细胞表面暴露的PA5158蛋白胞外区的抗体(IgG)。在相同条件下，完整细胞ELISA使用如同绿脓杆菌那样也是革兰氏阴性细菌的大肠杆菌(ATCC25922)实施。作为结果，从作为阴性对照的假手术大鼠血清中纯化的IgG级分(50ng/ml)的吸光度是0.118，而从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化的IgG级分(50jig/ml)的吸光度是O.O卯。另夕卜，用KLH-缀合的序列编号16的肽免疫的大鼠的血清中纯化的IgG级分(50ng/ml)的吸光度是0.072。这表明源自PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清和KLH-缀合肽免疫的大鼠血清的IgG级分中不含有识别大肠杆菌细胞表面暴露的抗原的抗体(IgG)。因此，该结果表明这些IgG级分可以在绿脓杆菌的检测中使用。实施例8:ELISA试验(l)检测与PA5158重组蛋白结合的抗体为了通过ELISA方法检测与PA5158重组蛋白结合的抗体，将PA5158重组蛋白溶解在补充有8M尿素的PBS中，并以0.5jig/孔的蛋白质浓度放置在96孔镍板(HIS-选择高敏感性(HS)镍包被板，Sigma)。该板置于室温l小时，以引起所述蛋白质与板结合。板随后用洗涤緩沖液(补充有0.05%吐温20、5mM咪唑和500mMNaCl的PBS)洗涤并以封闭緩沖液(补充有0.5%明胶的洗涤緩冲液)封闭。随后，在实施例5中获得的含抗体样品添加至孔内并且允许反应30分钟，并且随后洗涤该板。将第二抗体(过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体，10000倍稀释，Sigma)添加至板并且允许其反应30分钟，并且随后洗涤板。酶反应通过添加显色底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统，KPL)而实施，并且随后用1M磷酸终止。测定在450nm处的吸光度。作为结果，免疫前阴性对照血清(10，000倍稀释)的吸光度是0.058，而PA5158重組蛋白免疫的大鼠血清(10，000倍稀释)的吸光度是0.410。这表明在PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中含有与作为免疫原的PA5158重组蛋白相结合的抗体。另外，从仅施用佐剂的大鼠所获得的血清中纯化的阴性对照大鼠假IgG(10jig/ml)的吸光度是0.190，而从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化作为IgG级分的大鼠抗PA5158IgG(10fig/ml)的吸光度是2.918。这表明在大鼠抗PA5158IgG中含有与作为免疫原的PA51S8重组蛋白相结合的抗体。(2)检测与PA5158蛋白的推定胞外区肽结合的抗体为了通过ELISA方法检测与PA5158蛋白的推定胞外区肽(序列编号5、序列编号6)结合的抗体，将实施例5中合成的每种肽溶解在碳酸盐緩沖液(0.15%Na2C03和0.3%NaHCO;0中，并以lfig/孔或2jig/孔的肽浓度置于96孔板(MaxiSorp，Nunc)。该板在4。C放置过夜，以引起肽吸附在板上。板随后用PBS洗涤并以补充0.5。/。牛血清白蛋白的PBS封闭。随后，将实施例5中获得的含抗体样品在稀释后添加至孔内并且允许与所述肽反应1小时，并且板随后用含有0.05%吐温20的PBS洗涤。将第二抗体添加至孔内并且允许其反应30分钟，并且板随后用含有0.05%吐温20的PBS洗涤。显色反应和吸光度的测定以如上相同方式实施。作为结果，免疫前阴性对照血清(100倍稀释)的吸光度在用ljigPA5158蛋白推定胞外区肽(序列编号5)包被的孔内是0.053，而PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清(100倍稀释)的吸光度在这种孔内是0.445。这表明在PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中含有与PA5158蛋白的细胞外肽(序列编号5)结合的抗体。另外，从仅施用佐剂的大鼠的血清中纯化作为IgG级分的阴性对照大鼠假IgG(10ng/ml)的吸光度在用2jigPA5158蛋白推定胞外区肽(序列编号5)包被的孔内是0.135,而从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化作为IgG级分的大鼠抗PA5158IgG(10jig/ml)的吸光度在这种孔内是0.368。这表明在大鼠抗PA5158IgG中含有与PA5158蛋白的细胞外肽(序列编号5)结合的抗体。此外，在检测与PA5158蛋白推定胞外区肽(序列编号6)结合的抗体时，使用其中6个氨基酸添加至氨基末端以改善蛋白质溶解度的肽(序列编号17)来以2jig肽/孔包,皮孔。作为结杲，从仅施用佐剂的大鼠的血清中纯化作为IgG级分的阴性对照大鼠假IgG(100jig/ml)的吸光度是0.160，而从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化作为IgG级分的大鼠抗PA5158IgG(100fig/ml)的吸光度是0.589。这表明在大鼠抗PA5158IgG中含有与PA5158蛋白的细胞外肽(序列编号6)结合的抗体。实施例9:PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清防御PA103菌株感染的能左将悬浮在lOOjil含有5%粘蛋白的生理盐水中的活PA103菌抹以剂量1.0xl05cfu/小鼠(20个LDso)腹膜内施用至4周龄CD-1小鼠(从曰本CharlesRiver实-验室购买)，此后，PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清(全部血清样品用生理盐水稀释2.5倍)立即以剂量10ml/kg从尾静脉施用。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。作为结果，7只施用阴性对照大鼠假血清的小鼠中5只死亡，而在施用以福尔马林灭活的PA103菌林免疫的兔血清的组中全部小鼠存活。因此证实以福尔马林灭活的PA103菌株免疫的兔血清具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，在施用以PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有6只存活。因此证实PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。实施例10:PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清在中性白细胞减少症小鼠中防御PA103菌株感染的能力制备12.5mg/ml(生理盐水)的一7jc合环磷酰胺(本文中此后称作CY，Sigma-Aldrich)并以剂量125mg/kg在第-5、-2和0天^M内施用至4周龄CD-1小鼠，以降低外周血的中性白细胞水平。随后，将活PA103菌林以剂量1.83x105cfu/小鼠(136个LDso)腹膜内施用至所述小鼠。此后，PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清(全部血清样品用生理盐水稀释2.5倍)立即以剂量10ml/kg从尾静脉施用。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。作为结果，全部7只施用阴性对照大鼠假血清的小鼠死亡，而在施用以福尔马林灭活的PA103菌抹免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有4只存活。因此证实以福尔马林灭活的PA103菌林免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，在施用以PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有3只存活。因此证实PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。实施例lhPA5158重组蛋白免疫的大鼠血清在中性白细胞减少症小鼠中防御多药耐药性绿脓杆菌感染的能力多种类型抗菌剂对多药耐药性绿脓杆菌MSC06120菌林的最小抑制浓度是亚胺青霉烯(imipenem):32jig/ml，丁胺卡那霉素64ng/ml，和环丙沙星>256|ig/ml。制备12.5mg/ml(生理盐水)的CY并以剂量125mg/kg在第-5、-2和0天腹膜内施用至4周龄CD-1小鼠，以降低外周血的中性白细月包水平。随后，将活MSC06120菌抹以剂量1.23x10scfu/小鼠(ll个LDso)腹膜内施用至所述小鼠。此后，PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清(全部血清样品用生理盐7JC稀释2.5倍)立即以剂量10ml/kg从尾静脉施用。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。作为结果，7只施用阴性对照大鼠假血清的小鼠中有5只死亡，而在施用以福尔马林灭活的PA103菌林免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有6只存活。因此证实以福尔马林灭活的PA103菌抹免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，在施用以PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有6只存活。因此证实PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。实施例12:大鼠抗PA5158抗体在中性白细胞减少症小鼠中防御多药耐药性绿脓杆菌感染的能力将活MSC06120菌林以剂量1.18x105cfu/小鼠(10个0)5())腹膜内施用至小鼠。从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化作为IgG级分的大鼠抗PA5158IgG立即以剂量1mg/小鼠从尾静脉施用。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。作为结果，7只施用阴性对照大鼠假IgG(1mg/小鼠)的小鼠中有4只死亡，而施用从用福尔马林灭活的PA103菌抹免疫的大鼠血清中纯化的作为IgG级分的大鼠抗PA103IgG的组中全部7只小鼠存活。因此证实大鼠抗PA103IgG具有抗感染保护性活性。在这种条件下，在施用从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化的作为IgG级分的大鼠抗PA5158IgG的组中7只小鼠有6只存活。因此证实大鼠抗PAS158IgG具有抗感染的保护性活性。实施例13:单克隆抗体(MAb)的制备在用实施例5中制备的PA5158重组蛋白终末免疫1周后，将脾脏在麻醉下无菌取出。获得的脾脏用RPMI-l640培养基(Gibco)洗涤，并且随后把脾脏夹在载玻片之间并压碎，以获得作为细小片的脾细胞试验样品。通过使用RPMI-1640培养基在1200转/分钟离心5分钟洗涤获得的脾细月包。另一方面，骨髓瘤细胞(P3X63Ag8Ul细胞)在5。/。C02、相对湿度100%和37。C条件下在含有10%FCS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基中事先培养，并且将如此培养的在对数生长期间的骨髓瘤细胞通过4吏用RPMI-1640培养基离心洗涤并且与前述脾细胞混合，使脾细胞数对骨髓瘤细胞数的比例变成约4:1。混合的细胞在1000转/分钟离心10分钟。弃去上清液并充分地使细胞疏松。对含有细胞的离心管，温和地添加1mL由2g聚乙二醇(分子量1000，WakoPureChemicalIndustries)、2mLRPMI-1640培养基和0.2mLDMSO(NacalaiTesque)组成的溶液。细胞通过緩慢地旋转离心管而混合。l分钟后，緩慢地旋转离心管，同时15mLRPMI-1640培养基经3分钟添加至该离心管。细胞在1000转/分钟离心7分钟。随后，弃去上清液并充分地使细胞疏松。此后，使用HAT培养基(Gibco)，将细胞浓度按脾细胞调节至1.6Xl(^个细胞/mL。得到的细胞以浓度0.2mL/孔分散至96孔微量板(SumitomoBakelite)。细胞在5%C02、相对湿度100%和37°C条件下培养。约l-2周后，在显孩支镜下观察孔内生长的杂交瘤。(1)目的抗体的筛选与绿脓杆菌细胞表面结合的抗体通过实施例7中描述的完整细胞(wholecell)ELISA检测。另外，与PA5158重组蛋白或PA5158蛋白推定胞外区(序列编号5或序列编号6)结合的抗体通过实施例8中描述的ELISA检测。(2)克隆产生目的抗体的细胞^使用10%FCS/HT培养基将BALB/c小鼠胸腺细胞的浓度调整至2x107个细胞/mL。得到的细胞以浓度0.1mL/孔分散至96孔微量板(SumitomoBakdite)。细胞在5%C02、相对湿度100%和37。C条件下培养过夜。在次日，对通过筛选确定的产生目的抗体的杂交瘤使用10%FCSHT(Gibco)培养基调节至5个杂交瘤/0.1mL，并且以浓度0.1mL/孔分散至其中已经在前一日分散有胸腺细胞的孔内。l至2周后，可以在显微镜下观察克隆的生长。克隆通过在"篩选"段落中所述的方法分析，以选择到产生目的抗体的克隆。将具有由前述方法使用10。/。FCS/HT(Gibco)培养基调整至1个杂交瘤/0.1mL浓度的杂交瘤以O.lmL/孔的浓度分散至其中已经在前一日分散有胸腺细胞的孔内。l至2周后，可以在显微镜下观察克隆的生长。克隆通过在"筛选"段落中所述的方法分析，以选择到产生目的抗体的单克隆。(3)细胞的体外培养和MAb的产生在96孔微量板中充分增殖的目的克隆在24-孔板、50-mL烧瓶和250-mL烧瓶逐阶段放大并在100%FCS-RPMI培养基中培养。对如此获得细胞的培养上清中产生的MAb由实施例8中描述的ELISA检测。实施这种ELISA以检测对孔的结合作用，其中实施例5的合成肽(序列编号15)已经吸附在所述孔上，所述的合成肽含有序列编号5的胞外区，所述的胞外区基于有关绿脓杆菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的立体结构信息、有关大肠杆菌TolC蛋白(Nature，2000，405，914-919)的立体结构信息和有关PA5158蛋白的二级结构信息而估计。作为结果，在这种ELISA中，吸光度在作为阴性对照的10%FCS-RPMI培养基中是0.053，而吸光度在杂交瘤的培养上清液中是0.903，其中所述的杂交瘤以保藏号FERMBP-10672保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。因此表明产生了与所迷肽结合的MAb。实施例14:增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性已经报道PA5158蛋白是一种构成直接参与氨基糖苷类抗生素耐药性的;充出泵的夕卜膜蛋白(AntimicrobialAgentsandChemotherapy,2003，47，1101-1111)。这种蛋白质中的缺损突变林具有对氨基糖苷类抗生素增加的敏感性。因此，测试了由本发明人获得的识别这种蛋白质的多种类型抗体是否具有对氨基糖苷类抗生素流出泵的抑制作用。绿脓杆菌PA103菌株(ATCC29260)在37。C在Mudler-Hinton液体培养基中振荡培养过夜并用相同培养基稀释至lxl0Scfu/ml。随后，将菌株在37。C振荡培养。2小时后，以浓度0.125ng/ml添加庆大霉素。类似地，PBS以浓度300fig/ml添加至阴性对照组。以浓度300jig/ml分别添加由在保藏号FERM-BP-10672下保藏的杂交瘤产生的作为单克隆抗体的大鼠抗PA5158L1IgG、从KLH-缀合肽(序列编号6)免疫的大鼠血清中纯化的作为IgG级分的大鼠抗PA5158L2IgG和从PA5158重组蛋白免疫的大鼠血清中纯化的作为IgG级分的大鼠抗PA5158IgG至抗体添加组。随后，振荡培养在37。C实施4小时，并且测定了每个组中的活菌株数目。作为结果，菌林在对照组中增殖至1.05xl()Scfu/ml，而菌抹在阴性对照组中增殖至5.4xl06cfu/ml。此外，菌抹在添加抗体的组中分别增殖至6.4x105cfu/ml、7.5x105cfu/ml和6.3x10scfu/ml，其中全部组比阴性对照组中的活菌林数目更低。因此证实每一种抗体均具有增强氨基糖苷类抗生素庆大霉素的抗微生物活性的作用。全部抗体具有能够与构成氨基糖苷类抗生素流出泵的PA5158蛋白或其序列的部分相结合的特性。因此估计本发明增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的作用因抑制流出泵而产生。权利要求1.抗原组合物，其包含能够诱导产生抗绿脓杆菌PA5158蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原。2.蛋白质，其选自(i)包含序列编号4的氨基^列的蛋白质；(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基^列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和(iv)蛋白质，包含与序列编号4的M酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。3.肽，其包含序列编号5的氨基酸序列或含有一个至数个保守性替换的序列编号5的氨基,列。4.肽，其包含序列编号6的氨基酸序列或含有一个至数个保守性替换的序列编号6的氨基*列。5.抗原组合物，其包含根据权利要求2所述的蛋白质或根据权利要求3或4所述的肽。6.用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗組合物，其包含根据权利要求1或5所述的抗原组合物，和任选地一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。7.针对绿脓杆菌PA5158蛋白或其部分的抗体或其功能性片段。8.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的部分是绿脓杆菌PA5158蛋白的细胞表面暴露部分。9.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的细胞表面暴露部分选自(i)包含序列编号4的氨基^列的蛋白质；(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基M列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。10.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的细胞表面暴露部分是包含序列编号5的氨基酸序列的肽或包含序列编号5的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽。11.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其通过在保藏号FERMBP-10672下保藏的杂交瘤产生。12.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其中绿脓杆菌PA5158蛋白的细胞表面暴露部分是包含序列编号6的氨基酸序列的肽或包含序列编号6的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽。13.根据权利要求7至12任一项中所述的抗体或其功能性片段，其中抗体是单克隆抗体。14.在保藏号FERMBP-10672下保藏的杂交瘤。15.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其是与由权利要求14所述杂交瘤产生的单克隆抗体的相同抗原发生交叉反应的单克隆抗体。16.用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，其包含才艮据权利要求7至9中任一项所述的抗体或其功能性片段，和任选地一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。17.根据权利要求6所述的疫苗组合物或根据权利要求16所述的药物组合物，其中与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌感染所引起的全身性感染疾病。18.根据权利要求6所述的疫苗组合物或根据权利要求16所述的药物组合物，其中绿脓杆菌感染是多药耐药性绿脓杆菌感染。19.用于绿脓杆菌感染的诊断剂，其包含根据权利要求7至13和15任一项中所述的抗体或其功能性片段。20.用于检测绿脓杆菌的试剂盒，其包含根据权利要求7至13和15任一项中所述的抗体或其功能性片段。21.增强氨基糖苷类抗生素的抗绿脓杆菌活性的增效剂，其包含根据权利要求7至13和15任一项中所述的抗体或其功能性片段。全文摘要本发明的目的旨在提供用于诊断、预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的蛋白质抗原或肽抗原和抗所述抗原的抗体。根据本发明，提供了衍生自绿脓杆菌外膜蛋白PA5158的蛋白质或肽和针对它们的抗体，用于诊断、预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病。文档编号C07K16/12GK101351221SQ20068004961公开日2009年1月21日申请日期2006年10月27日优先权日2005年10月28日发明者大冢圭子,大泽福市,奥富隆文,熊谷正志,田中二朗,铃木贵久,长曾宏申请人:明治制果株式会社