专利名称：夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗。
背景技术：
肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是一种重要的病原菌，主要包括0157:H7、C^6:H11和0111等数种血清型。其中，E. coli 0157:H7 导致的感染占EHEC感染的50% 80%。E. coli 0157:H7感染能引起人的出血性结肠炎 (Hemorrhagic colitis，HC)、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重的胃肠道并发症。10% E. coli 0157:H7感染病例，特别是儿童和老年人，还可引起致死性的溶血性尿毒综合征 (Haemolytic uraemic syndrome，HUS)等全身性并发症。近年来，E. coli 0157:H7 的暴发流行在世界各地时有发生，尤其在日本、美国、英国等地。我国江苏、安徽等地1999、2001年也相继发生了 E. coli 0157:H7感染的暴发流行，患者超过两万人。统计显示，90%的E. coli 0157:H7感染病例是散发，实际上反映了未被识别的暴发流行，或在众多隐性感染者中存在低强度流行。近期发生的欧洲肠道传染病疫情危害凸显，2011年5月1日德国出现第一例病例，一个多月来，一场罕见的、带有强毒性的0104:H4型肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情席卷了欧洲很多国家。世界卫生组织(WH0)15日发布的疫情通报称，感染人数达3343人，感染者中有823人出现了溶血性尿毒综合征(HUQ症状，37人死亡。EHEC感染是一种新发的危害严重的食物源性肠道传染病和人畜共患病。目前普遍认为受污染家畜及食物是该病的主要传染源，并且普遍存在毒素与活菌的共同感染。抗生素的使用会导致更多毒素的分泌而不被推荐临床治疗采用。因此，控制该病暴发流行的最好措施是疫苗免疫，目的是预防人的原发感染和在已感染患者中防止严重并发症的出现。0157 H7与新发现的0104 H4型等EHEC病原菌的一个重要的特征性毒力因子是志贺毒素(Shiga toxins, Stxs) ο Stxs是导致EHEC感染病人出现HC、HUS的主要原因。临床与试验研究认为，针对E. coli 0157:H7感染，常规的抗生素治疗会导致菌体裂解、Stxs瀑流释放，增加发生HUS的风险13. 4倍。Mxs包括Mxl和两个亚型，具有不同的抗原表位，但具有相同的分子结构及受体，毒性机理也相似。完整毒素均呈现1A:5B结构。A亚单位具有细胞内毒性，能发挥RNA糖苷酶的活性，特异裂解^S rRNA，从而抑制细胞蛋白质合成，导致细胞死亡。B亚单位能特异结合球丙糖酰基鞘氨醇(( 或者球丁糖酰基鞘氨醇0Λ4)受体，从而引导A亚单位发挥作用。有研究认为，Stx2毒性要强于Mxl，更相关于 HUS0鉴于Mxs在诱发感染性系统并发症中的关键作用，Stxs也是预防感染性HUS的核心靶点之一。目前临床对于EHEC感染仍缺乏有效的防治办法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。因此，设计一种新型疫苗，能够将重要毒力相关的非膜保护性抗原进行展示或递送，使多组分抗原共提呈给宿主，就有望提供更为有效和全面的免疫保护。细菌菌蜕(bacterial ghost, BG)是一种最新发展起来的生物传递系统。细菌菌蜕是革兰阴性细菌被噬菌体phiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳。其形成是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的。BG的形成主要依赖于裂解蛋白E在细胞膜上的跨膜孔道作用，胞内的细胞质和核酸成分在渗透压的作用下经跨膜孔道被排出，形成一个只含有细胞膜结构的空细菌体。BG兼顾了组合抗原免疫原性、佐剂效应、靶向性载体的作用，既能携带外源抗原，又能同时递送核酸和其他药物，特别适合于粘膜免疫及口服免疫及滴鼻免疫，并适宜大规模生产。同时，由于菌蜕缺乏遗传物质，消除了耐药基因或毒力岛基因的水平转移等引起的潜在危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫
田ο本发明提供的融合蛋白，为融合蛋白甲或融合蛋白乙；所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段序列表的序列2自N末端第1 至136位氨基酸残基组成的片段甲、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列2第635至7 位氨基酸残基组成的片段丙；所述融合蛋白乙为在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之间插入外源蛋白得到的融合蛋白。所述片段甲和所述片段乙组成OmpA N端片段。所述片段丙即为OmpA C端片段。所述外源蛋白的氨基酸序列可如序列表的序列4(即序列表的序列2自N末端第 139至509位氨基酸残基)所示(SAmB蛋白)。所述融合蛋白乙优选为序列表的序列2所示的蛋白。所述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述片段甲的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1至408位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1至408位核苷酸)。所述片段乙的编码序列具体可如序列表的序列1自5’末端第457至825位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1534至1902位核苷酸)。所述片段丙的编码序列具体可如序列表的序列1自5’末端第拟6至1104位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1903-2181位核苷酸)。所述外源蛋白的编码基因优选为序列表的序列5所示的DNA分子(即序列表的序列3中自5’末端第415至1527位核苷酸)(SAmB基因)。所述融合蛋白乙的编码基因优选为序列表的序列3所示的DNA分子。含有所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pGEX载体(如pGEX-KG载体)的多克隆位点插入以上任一所述基因得到的重组质粒。所述重组表达载体优选为将序列表的序列1所示DNA 或序列表的序列3所示DNA插入pGEX-KG载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组菌具体可为如下(a)或(b)(a)含有以上任一所述重组表达载体的细菌；(b)含有以上任一所述重组表达载体并表达裂解酶的细菌；所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列6所示。所述(a)中，所述细菌优选为大肠杆菌，最优选为肠出血性大肠杆菌0157:H7(如EDL933 菌株)。所述(b)中，所述表达裂解酶的细菌优选为含有温控裂解质粒P-LysisE的大肠杆菌，所述大肠杆菌优选为肠出血性大肠杆菌0157 :H7 (如EDL933菌株)。以上任一所述的重组菌的菌蜕也属于本发明的保护范围。所述菌蜕菌体具体可通过如下方法制备得到将所述重组菌培养至0D_为 0.3，然后加入IPTG(在菌液中的初始浓度为ImM) 200rpm培养至OD6tltl约为0.6 ；升温至 42°C，收集42°C培养1小时的菌液，5000 Xg离心15min收集沉淀，即为菌蜕。所述融合蛋白、所述基因、所述重组表达载体或所述重组菌可用于制备细菌菌蜕。 所述细菌了可为大肠杆菌(E.coli)。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌0157:H7，所述大肠杆菌具体可为肠出血性大肠杆菌0157:H7 EDL933或肠出血性大肠杆菌88321。本发明还保护一种细菌疫苗，它的活性成分为以上任一所述菌蜕。所述细菌了可为大肠杆菌(E.coli)。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌0157:H7，所述大肠杆菌具体可为肠出血性大肠杆菌0157:H7 EDL933或肠出血性大肠杆菌88321。本发明还保护以上任一所述菌蜕在制备细菌疫苗中的应用。所述细菌了可为大肠杆菌(E.coli)。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌0157:H7，所述大肠杆菌具体可为肠出血性大肠杆菌0157:H7 EDL933或肠出血性大肠杆菌88321。相比0157:H7菌蜕，0157:H7嵌合菌蜕由于展示了 Stx毒素抗原，其免疫血清能产生特异的抗Stx2A和StxlB抗体。0157:H7嵌合菌蜕诱导的血清抗体具有中和Stx毒素的功能，因此，其免疫血清能有效抵抗致死剂量的裂解菌攻击O LD50，保护率73.3%)。 0157 H7嵌合菌蜕免疫小鼠的肠灌洗液抗intimin特异抗体效价显著高于0157 H7菌蜕，说明OSAmB菌蜕表面intimin的免疫原性有所增强。0157 :H7嵌合菌蜕免疫小鼠比0157: H7菌蜕(12% )更好的保护小鼠(52% )抵抗高致死剂量大肠杆菌0157:H7活菌的灌胃攻击。一方面可能是更高效价的intimin抗体更好的阻断了大肠杆菌0157 :H7病原菌对肠道的黏附，另一方面可能是抗^xs特异抗体能中和灌胃菌裂解产生的^xs毒素，有效的减少了毒素对机体产生的损伤。进一步的病理结果揭示了腹腔裂解菌攻毒的主要致死作用在于毒素效应(肾损伤)，而更接近于正常感染途径的灌胃攻毒除了肾组织外，还产生了严重的黏附擦拭损伤(肠道损伤)。因此，只有采用既能抗病原菌黏附，又能抗毒素攻击的0157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠才能更全面、更有效保护小鼠抵抗大肠杆菌0157:H7病原菌的感染。本发明以夹心外膜蛋白A(融合蛋白甲)作为展示载体，将重要的E.coli 0157:H7 非膜毒素保护性抗原(SAmB蛋白)在E.coli 0157:H7细菌外膜上锚定表达。以细菌菌蜕为传递系统，E.coli 0157:H7原有膜表面抗原与新的展示抗原就可以一起提呈给免疫细胞， 在预防细菌肠道定植以及抗毒素方面共同发挥作用，以诱导更全面的免疫保护。
图1为夹心OmpA载体特异DNA片段的电泳图；1 :PCR产物；M =DNA标志物。图2为插入SAmB基因后的夹心OmpA载体特异DNA片段的电泳图；M =DNA标志物； 1 连接产物。图3为重组菌的PCR鉴定电泳图；M. DNA标志物；1 温控裂解质粒特异引物对鉴定；2 重组质粒pOSAmB特异引物对鉴定。图4为0157 :H7嵌合菌蜕的免疫反应性；A :0157 :H7嵌合菌蜕与抗Stx2A兔血清的免疫反应性；B :0157 :H7嵌合菌蜕与抗StxlB鸡IgY的免疫反应性；1 =OSAmB嵌合菌蜕； 2 :0157 :H7菌蜕；3 :0mpA载体缺失对照菌蜕；4 :Stx2A(A) ^StxlB(B) ；M 低分子量蛋白标准物。图5为0157 :H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的鉴定；A :0157 :H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的抗Mx2A兔血清鉴定；B :0157 :H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的抗MxlB鸡IgY鉴定；C 0157 :H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的抗intimin兔血清鉴定；OSAmB代表0157 :H7嵌合菌蜕； non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；B(is代表0157 :H7菌蜕。图6为0157 :H7嵌合菌蜕的细胞毒效应(* =P > 0. 05 vs non-OmpA) ；RBGs代表 0157 :H7嵌合菌蜕；non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；0157:H7代表病原菌。图7为0157 :H7嵌合菌蜕免疫小鼠诱导抗菌蜕特异抗体水平监测(* =P < 0. 01 vs PBS ；# =P < 0. 01 vs PBS ；** =P < 0. 01 ’## :P < 0. 05) ；A 血清中 IgA特异抗体效价；B 肠灌洗液中IgA特异抗体效价；C 血清中IgG特异抗体效价；D 肠灌洗液中IgG特异抗体效价；RBk代表0157 :H7嵌合菌蜕；non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；PBS代表磷酸盐缓冲液。图8为0157 :H7嵌合菌蜕免疫小鼠诱导抗Mxl特异抗体水平监测(* =P < 0. 01 vs PBS ；# =P > 0. 05 vs PBS ；## =P > 0. 05 vs PBS) ；A 血清中 IgA 特异抗体效价；B 肠灌洗液中IgA特异抗体效价；C 血清中IgG特异抗体效价；D 肠灌洗液中IgG特异抗体效价； RBGs代表0157 :H7嵌合菌蜕；non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；PBS代表磷酸盐缓冲液。图9为0157 :H7嵌合菌蜕OSAmB免疫小鼠诱导抗特异抗体水平监测(* =P
<0. Olvs PBS ；# :P > 0. 05vs PBS ;## :P > 0. 05 vs PBS) ；A :血清中 IgA 特异抗体效价； B 肠灌洗液中IgA特异抗体效价；C 血清中IgG特异抗体效价；D 肠灌洗液中IgG特异抗体效价；RB(is代表0157 :H7嵌合菌蜕；non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；PBS代表磷酸盐缓冲液。图10为0157: H7嵌合菌蜕免疫小鼠抵抗病原菌(大肠杆菌0157: H7 EDL933)灌胃途径攻击的生存率；A IO9CFU大肠杆菌0157:H7 EDL933 (相当于100 LD50) ；B 5 X IO9CFU 大肠杆菌 0157 :H7 EDL933 (相当于 500 LD50) ；* :P < 0. 01 vs PBS ；** :P < 0. Olvs non-OmpA ；# :P < 0. 01 vs PBS ;## :P > 0. 05 vs non-OmpA ；RBGs 代表 0157 :H7 嵌合菌蜕； non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；PBS代表磷酸盐缓冲液。图11为0157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠抵抗裂解病原菌(大肠杆菌0157:H7 88321)腹腔途径攻击的生存率；A 2 LD50大肠杆菌0157:H7 88321 ；B 5 LD50大肠杆菌 0157:H788321 ;* :P < 0. 01 vs PBS ;** :P < 0. 01 vs non-OmpA. RB(is 代表 0157 :H7 嵌合菌蜕；non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕；PBS代表磷酸盐缓冲液。图12为0157:H7嵌合菌蜕免疫血清体外中和裂解病原菌(大肠杆菌0157:H7 88321)效应；A :2 LD50 大肠杆菌 0157:H7 88321 ；B 5 LD50 大肠杆菌 0157:H7 88321 ;* :P
<0. 01 vs PBS ；** :P < 0. 01 vs non-OmpA. RBGs 代表 0157 :H7 嵌合菌蜕；non-OmpA 代表 OmpA载体缺失菌蜕；Bk代表0157 :H7菌蜕；PBS代表磷酸盐缓冲液。图13为小鼠病理组织H&E染色；A 正常小鼠；B 大肠杆菌0157:H7 EDL933活菌灌胃攻击保护小鼠；C 大肠杆菌0157:H7 88321腹腔攻击保护小鼠；D 大肠杆菌0157:H7 EDL933活菌灌胃攻击死亡小鼠；E 大肠杆菌0157:H7 88321腹腔攻击死亡小鼠。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。表1嵌合菌蜕构建所用引物(下划线序列为限制性酶切位点)
权利要求
1.融合蛋白，为融合蛋白甲或融合蛋白乙；所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、序列表的序列2 自N末端第512位至634位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列2第635至7 位氨基酸残基组成的片段丙；所述融合蛋白乙为在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之间插入外源蛋白得到的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述外源蛋白的氨基酸序列如序列表的序列4所示。
3.权利要求1或2所述融合蛋白的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述片段甲的编码基因如序列表的序列1自5’末端第1至408位核苷酸所示；所述片段乙的编码序列如序列表的序列1自5’ 末端第457至825位核苷酸所示；所述片段丙的编码序列如序列表的序列1自5’末端第拟6至1104位核苷酸所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为如下(a)或(b)(a)含有所述重组表达载体的细菌；(b)含有所述重组表达载体并表达裂解酶的细菌；所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列6所示。
7.权利要求5或6所述的重组菌的菌蜕。
8.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3或4所述基因、或权利要求5或6所述重组表达载体或重组菌在制备细菌菌蜕中的应用。
9.一种细菌疫苗，它的活性成分为权利要求7所述菌蜕；或，权利要求7所述菌蜕在制备细菌疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述的细菌疫苗或所述的应用，其特征在于所述细菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗。本发明提供了两种融合蛋白，为融合蛋白甲或融合蛋白乙；所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列2第635至726位氨基酸残基组成的片段丙；所述融合蛋白乙为在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之间插入外源蛋白得到的融合蛋白。将本发明的融合蛋白的编码基因导入细菌，可以得到重组菌。该重组菌的菌蜕可以作为细菌疫苗，该细菌疫苗不含有细菌的基因组，但含有所述融合蛋白，安全且效果良好。
文档编号A61P31/04GK102286106SQ20111019271
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者侯晓军, 李涛, 王慧, 王琴, 蔡昆 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所