一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下步骤：S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物；S2、提取溶藻弧菌基因组DNA；S3、以溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增；S4、取PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小；S5、将PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH?I和Xho?I双酶切后，通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E.coli?DH5a菌株。本发明成功构建OmpK表达载体，确定OmpK蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件，为OmpK工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。
【专利说明】-种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种原核载体构建方法，具体涉及一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核 载体构建方法。
【背景技术】
[0002] 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，V. alginolyticus)为革兰阴性菌，分布于海 域、河口地区，可引起水产鱼类败血症和胃肠炎，造成大量死亡，严重影响水产养殖业的发 展；也可引起人类胃肠道疾病与伤口感染；是一种人和海洋动物共感染的病原菌。
[0003] 溶藻弧菌外膜蛋白（Outer membrance proteins, OMPs)是外膜的重要组成部分， 在感染和诱导宿主免疫反应上起重要作用；其中外膜蛋白K (Outer membrance protein K， OmpK)为溶藻弧菌主要的外膜蛋白，在不同弧菌间具有序列保守性，存在交叉免疫反应，是 弧菌间共同抗原的分子基础。此外，OmpK对弧菌感染具有很好的免疫保护作用，在疫苗上 有很好的应用前景。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法， 并对OmpK蛋白发酵的实验室小试条件进行研究。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] 溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下步骤：
[0007] S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primerl :5' -ACA GGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3' ；Primer2 :5' -ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3' ；
[0008] S2、提取溶藻弧菌基因组DNA ;
[0009] S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增；
[0010] S4、取S3中的PCR扩增产物采用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小；
[0011] S5、将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后， 通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E. coli DH5a菌株，提取重组质粒后， 进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引 物进行对比，转化重组质粒入E. coli BL21表达菌株。
[0012] 优选的，所述步骤S3中PCR扩增条件为：PCR扩增采用50 μ L反应体系，反应缓冲 液 5 μ L，基因组模板 3 μ L，10mmol/L dNTP2 μ L，25umol/L 引物各 1. 5 μ L，Taq 酶 0· 5 μ L，补 水至50 μ L。
[0013] PCR扩增反应条件为：94°C变性3min ;30个循环：94°C变性40s，55°C退火45s， 72°C延伸60s ;72°C延伸10min，最后4°C保温。
[0014] 其中，本发明通过选用L9(34)正交试验，得出了 OmpK菌株最佳诱导表达条件为： 诱导时菌液〇D6(?值0. 8,加 IPTG终浓度0. 3mmol/L，诱导时间8h，温度32°C;最佳培养条件 为：转速230rpm，葡萄糖浓度0 %，装液量50mL。
[0015] 本发明的有益效果如下：
[0016] 上述方案中，成功构建OmpK表达载体，确定OmpK蛋白菌株的最佳表达条件与培养 条件，为OmpK工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。利用切胶纯化蛋白方法获得 OmpK蛋白，免疫小鼠，制备多克隆抗体，再通过ELISA与Wester-Blotting方法检测多抗的 效价与特异性。并通过L 9 (34)正交试验设计，筛选OmpK工程菌最佳表达与培养条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为溶藻弧菌ompK基因重组质粒构建对比图。
[0018] A :PCR扩增ompK基因：1，阴性对照；2, ompK基因 ；B :BamH I与Xho I双酶切检测 ompK基因重组质粒：1，ompK重组质粒；2, ompK重组质粒BamH I+Xho I双酶切。
[0019] 图2为OmpK蛋白表达与纯化图。
[0020] M，Protein marker ;1，未诱导菌株；2, IPTG诱导菌株；3, OmpK蛋白纯化。
[0021] 图3为OmpK多克隆抗体效价的测定结果图。
[0022] 图4为OmpK多克隆抗体特异性的Western-Blotting检测结果图。
[0023] A，1 : 400倍稀释的抗血清；B，1 : 800倍稀释的抗血清；C :1 : 1600倍稀释的抗 血清；D:1 : 400倍稀释的阴性对照血清。
[0024] 图5为OmpK菌株IPTG诱导的正交试验结果图。
[0025] M :Protein marker ;1-3 :IPTG 诱导 3h，诱导温度为 28°C、32°C、37°C;4-6 :IPTG 诱 导 8h，诱导温度为 28°C、32°C、37°C ;7-9 :IPTG 诱导 12h，诱导温度为 28°C、32°C、37°C。
【具体实施方式】
[0026] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0027] 本发明实施例中的试验材料：溶藻弧菌，E. coli BL21菌株，E. coli DH5a菌株， pET-32a质粒本实验中心保存；昆明鼠购于西安交通大学实验动物中心；引物合成由西安 沃尔森生物技术有限公司完成。
[0028] 主要试剂：Taq酶，限制性内切酶，T4-DNA连接酶，NDA Marker，Protein Marker，均 为Takara公司产品；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒为上海生物工程公司；IPTG、蛋白胨， 酵母粉购于美国MP公司；二抗购于Sigma公司，其它试剂均为分析纯。
[0029] 本发明实施例提供了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下 步骤：
[0030] S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primerl :5' -ACA GGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3' ；Primer2 ：5, -ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3' ;下划线为 限制性内酶位点BamH I和Xho I。
[0031] S2、提取溶藻弧菌基因组DNA ;
[0032] S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增；
[0033] S4、取S3中的PCR扩增产物采用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小；
[0034] S5、将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后， 通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E. coli DH5a菌株，提取重组质粒后， 进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引 物进行对比，用BamH I和Xho I双酶切重组质粒获得约800bp片段，与目的基因大小一致， 序列测序结果证实与NCBI公布的基因序列相同，证明成功构建重组质粒，转化重组质粒入 E. coli BL21表达菌株。
[0035] 取经鉴定正确的重组菌株过夜培养，以1 : 100倍转接入新鲜的LB培养基中，待 0D6Q(I约0. 6时，加入终浓度0. 5mM IPTG，37°C诱导培养5h，收集菌体，蛋白电泳检测OmpK蛋 白表达情况；并利用SDS-PAGE电泳切胶的方法，对OmpK蛋白进行纯化。为检测重组蛋白的 表达情况，将OmpK表达菌株经IPTG诱导后，蛋白电泳获得约50kDa的蛋白条带，包含OmpK 约30kDa，以及pET-32a质粒自带的20. 4kDa融合蛋白标签，重组蛋白表达情况与预期大小 一致；并利用SDS-PAGE电泳切胶的方法获得纯化的OmpK蛋白，如图2所示。
[0036] 选用4-5周龄的昆明鼠5只，每只免疫100 μ g，第1次采用弗氏完全佐剂，免疫14d 后进行第2次免疫，第2次免疫7d后,进行第3次加强免疫，免疫7天后小鼠眼部取血。将 血清至于4°C冰箱中过夜析出，离心后取上清，_80°C冰箱中保存备用。小鼠经过3次免疫 后，获得的OmpK蛋白抗血清经ELISA法测定，利用ELISA法检测抗血清效价，简要步骤为： 将OmpK蛋白溶解至5 μ g/ μ L，在对应的96孔板中加入100 μ L抗原，37 °C孵育3h ;倒空液 体，洗涤液清洗3次，加入300 μ L封闭液，37°C孵育2h ;洗涤后，每孔加100 μ L -抗，37°C 孵育40min ;洗涤后加入100 μ L二抗（1 : 3000)，室温孵育40min ;充分洗涤加入50 μ L底 物Α与50yL底物Β的混合液，37°C避光显色10min，最后加入终止液，450nm读数，发现其 抗体效价可以达到1 : 1600,如图3所示。
[0037] 采用Western-Blotting方法检测OmpK小鼠抗血清特异性，简要步骤为：将溶藻弧 菌培养，加入蛋白上样缓冲液，煮样5min后，SDS-PAGE蛋白电泳，转NC膜，加入不同稀释度 的小鼠抗血清（对照加入阴性抗血清），洗涤后，加入二抗孵育，最后DAB显色，确定OmpK抗 血清的特异性。发现不同稀释度OmpK抗血清出现明显条带；而对照阴性抗血清无对应条带 (图4)。表明OmpK抗血清可与OmpK蛋白特异性结合，成功制备OmpK蛋白小鼠抗血清。
[0038] 为确定OmpK蛋白最佳表达条件，选用L9(34)正交试验，将正交试验分为培养条件 与蛋白诱导表达条件2个部分，因子与水平见表1和表2所示。
[0039] 表1 OmpK表达菌株培养条件的正交试验因子与水平
[0040]
【权利要求】
1. 溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primerl :5'-ACAGGATCCATGCGTAA ATCACTTTT-3' ；Primer2 :5' -ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3' ； 52、 提取溶藻弧菌基因组DNA ; 53、 以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增； 54、 取S3中的PCR扩增产物采用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小； 55、 将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后，通过 T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E. coli DH5a菌株，提取重组质粒后，进行 BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引物进 行对比，转化重组质粒入E. coli BL21表达菌株。
2. 如权利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，其特征在于，所述 步骤S3中PCR扩增条件为：PCR扩增采用50 μ L反应体系，反应缓冲液5 μ L，基因组模板 3μ L，10mmol/L dNTP2y L，25umol/L 引物各 1. 5μ L，Taq 酶 0· 5μ L，补水至 50μ L。 PCR扩增反应条件为：94°C变性3min ;30个循环：94°C变性40s，55°C退火45s，72°C延 伸60s ;72°C延伸lOmin，最后4°C保温。
【文档编号】C12N15/66GK104140975SQ201410353500
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】刘祥, 陈春琳, 俱雄 申请人:陕西理工学院