专利名称：：钩端螺旋体疫苗候选的外膜蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物技术与医学领域，具体涉及可作为候选疫苗的钩端螺旋体外膜蛋白。
背景技术：
：钩端螺旋体是一种细长、弯曲呈螺旋状、运动活泼的，属于螺旋体目(Spirocheatals)螺旋体禾斗(Spirocaetaleae)钩端螺旋体属(leptospira)的原核细胞型微生物。以前，把钩端螺旋体分为2个种致病性问号钩端螺旋体a.interrogans广义)和腐生型双曲钩端螺旋体CLbiflexa广义)。问号钩端螺旋体根据交叉凝集实验又可分为不同血清型，至少可分为25个血清群，200余个血清型。我国有18群75型，是世界上发现血清型最多的国家。近年来根据DNA-DNA杂交的结果对钩端螺旋体进行了根据基因种的分类。目前共分为17个基因种，其中致病性钩端螺旋体主要有丄.！>2^rogam(狭义)，丄.hV^c/z"en'，丄.wogwc/w'/，Z.Zor⑨e&raewX丄.sawtorasa6禾口丄.H^z7z7等基因禾中。致病性牵勾端虫累方定体能引起的钩端螺旋病(Leptospirosis)，简称钩体病，是我国法定的乙类传染病。该病全球分布，是威胁人类健康和畜牧业生产的常见人兽共患病，已经有77个国家和地区报告有此病的存在，我国是受钩体病危害最为严重的国家之一，自1955年以来病例达250多万，死亡2万多人。本病在我国主要集中在长江流域以及南方其它大部分地区，以稻田型和洪水型为主。发病率与洪涝灾害、降雨量多少密切相关。每逢夏秋季节发病者众多，病势急剧。钩端螺旋体病主要临床表现是高热、头痛、寒战、乏力、淋巴结肿大和明显的肌肉疼痛。重者可并发肺出血、黄疸、脑膜脑炎和肾功能衰竭等。近年来，该病的发生在国外有所上升，甚至包括一些发达国家的一些地区。目前，由于缺乏有效的分子生物学研究手段，对其致病和免疫的机制了解还较粗浅。安全有效的疫苗是防治钩端螺旋体病的最好方法。钩端螺旋体疫苗先后经历了传统的全菌体疫苗、改良的浓縮疫苗和外膜疫苗时期，对防治钩端螺旋体病作出了一定贡献。但它们共同的缺点是免疫力不够持久，效价低，作用范围窄，需要每年在疫区进行免疫接种，同时都具有一定的副作用，并且不能引起交叉免疫保护，这些缺点限制了钩端螺旋体疫苗的应用。现在钩端螺旋体研究领域的重点之一是新型疫苗的研制，其核心是寻找合适的疫苗候选基因。在最近几年中，一些疫苗候选分子如Hap-l(LipL32)、LipL41、OmpLl、Lig、FlaB、Hsp58、SphH等相继被研究，虽然在一些动物实验中具有较好的免疫保护效果，但至今没有合适的钩端螺旋体亚单位疫苗进入临床，因此需要新的研究思路和方法进行钩端螺旋体疫苗研究。钩端螺旋体疫苗先后经历了传统的全菌体疫苗、改良的浓縮疫苗和外膜疫苗时期，对防治钩端螺旋体病作出了一定贡献。但它们共同的缺点是免疫力不够持久，效价低，作用范围窄，需要每年在疫区进行免疫接种，同时都具有一定的副作用，并且不能引起交叉免疫保护，这些缺点限制了钩端螺旋体疫苗的应用。
发明内容本发明的目的是提供可以作为候选疫苗的钩端螺旋体的外膜蛋白、及其片段、类似物、衍生物。本发明的另一目的是提供编码这个蛋白的多核苷酸。本发明的另一目的是提供生产这个蛋白的方法以及蛋白和编码序列的用途。在本发明的第一方面，提供分离出来的钩端螺旋体的外膜蛋白，如SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地不含信号肽序列。在本发明的第二方面，提供分离出来的编码上述多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性(a)编码上述钩端螺旋体外膜蛋白的多核苷酸；禾口(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQIDNO:l氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQIDNO:2的序列。在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载休转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。在本发明的第四方面，提供了制备钩端螺旋体外膜蛋白多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达钩端螺旋体外膜蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出钩端螺旋体外膜蛋白多肽。在本发明的第五方面，提供了与上述的钩端螺旋体外膜多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子。在本发明的第六方面，提供了检测样品中是否存在外膜蛋白的方法，它包括将样品与外膜蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在外膜蛋白。在本发明的第七方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明的钩端螺旋体外膜蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。在本发明的第八方面，提供了一种疫苗组合物，它含有安全有效量的本发明的钩端螺旋体外膜多肽或其片段以及药学上可接受的载体。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1是本发明LA3744基因克隆表达结果图2是本发明LA3744基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果图3是本发明LA3744纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析结果图4是本发明LA3744重组蛋白进行质谱分析鉴定结果图5是本发明LA3744在15个血清群代表株中的保守性鉴定结果图6是本发明PL40蛋白在15个血清群代表株中的保守性鉴定结果图7是本发明PL40蛋白用FACS检测是否为钩端螺旋体表面暴露蛋白结果图8是本发明PL40蛋白在TritonX-114提纯钩体不同膜组织成分中的分布图；图9是本发明中钩体感染哺乳动物时PL40蛋白的表达结果图；图10是本发明中感染钩体小鼠、豚鼠或金黄地鼠O,7,14禾卩28天后血清中anti-PL40抗体滴度结果图。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，从钩端螺旋体赖株中分离纯化和鉴定了一类新的外膜蛋白质，该外膜蛋白可作为抗原用于疫苗的设计和制备。在此基础上完成了本发明。在本发明中，术语"外膜蛋白"、"外膜多肽"或"钩端螺旋体外膜蛋白"可互换使用，都指具有钩端螺旋体外膜蛋白氨基酸序列(SEQIDNO:l)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的钩端螺旋体外膜蛋白，以及含有或不含有信号肽的外膜蛋白。如本文所用"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多月太是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用"分离的外膜蛋白或多肽"是指外膜多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化外膜蛋白。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，但优选的是非糖基化的。本发明还包括钩端螺旋体外膜蛋白，蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上^^持本发明的天然钩端螺旋体外膜蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或6类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(m)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语"钩端螺旋体外膜多肽"指具有钩端螺旋体外膜蛋白活性或免疫原性的SEQIDNO:1序列的多肽。该术语还包括具有与钩端螺旋体外膜蛋白相同功能的、上述序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。该术语还包括钩端螺旋体外膜蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与钩端螺旋体外膜蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗钩端螺旋体外膜多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含钩端螺旋体外膜多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了钩端螺旋体外膜多肽的可溶性片段。通常，该片段具有钩端螺旋体外膜多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。这些片段也可用作免疫原以诱导针对钩端螺旋体的免疫应答反应。发明还提供钩端螺旋体外膜蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然钩端螺旋体外膜多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。奉发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0,2xSSC，0.1%SDS，60°C:或(2)杂交时加有变性剂，如50X(v/v)甲酰胺，0.1X小牛血清/0.1XFico11，42。C等或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟的钩端螺旋体外膜蛋白有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码外膜蛋白的多聚核苷酸。本发明的钩端螺旋体外膜核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制各的DNA文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或外膜蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的外膜多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码钩端螺旋体外膜多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，钩端螺旋体外膜多核甘酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含钩端螺旋体外膜编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多^:。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选白各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。重组的钩端螺旋体外膜蛋白或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限于》作为抗原用于制备疫苗。另一方面，本发明还包括对钩端螺旋体外膜DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于钩端螺旋体外膜基因产物或片段。较佳地，指那些能与钩端螺旋体外膜基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的钩端螺旋体外膜基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的钩端螺旋体外膜基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达钩端螺旋体外膜蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。疫苗组合物本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与"药学上可接受的载体"组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(佐剂)作用。另外，抗原或免疫原可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于(l)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方(有或没有其它特异性的免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如，(a)MF59其含有5%鲨烯、O.5%的吐温80和0.5%Span85(任选地含有不同量的MTP-PE(见下文)，虽然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亚微米级颗粒；(b)SAF，其含有10%鲨烯、0.4%吐温80、5%普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr—MDP(见下文)，微量流化成业微米级乳剂或涡流振荡产生粒径较大的乳剂，和(c)Ribi佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton,MT)，其含有2%鲨烯、0.2%吐温80以及取自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(Detox);(3)阜素佐剂，例如可采用stimulon(cambridgeBioscience,Worcester,MA)或从其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激性复合物)；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA);(5)细胞因子，如白介素(如IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如Y干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M—CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，尤其是LT-K63、LT-R72，CT隱S109、PT隱K9/G129;参见例如W093/13302禾BW092/19265;以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(如可包括抗原，药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如7jC，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。"免疫学有效量"指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服制剂。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。作为以蛋白质为基础的疫苗的一种替代方案是，还可以采用DNA疫苗接种。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、基于生物信息学和基因芯片的基因组方法筛选钩端螺旋体疫苗候选基因1、生物信息学分析预测钩端螺旋体编码表面暴露蛋白的基因2、比较基因组学杂交筛选出在中国流行的十个流行血清群钩端螺旋体代表株中保守的基因3、转录组学分析鉴定钩端螺旋体基因组中高表达基因经过上述3个方法，最后从钩端螺旋体赖株基因组中筛选鉴定出226个疫苗候选基因数量。这226个疫苗候选基因表达的蛋白质不但是表面暴露蛋白，而且是在中国流行的大部分血清群的代表株中保守，并且具有较高的转录水平。二、钩端螺旋体两个新的疫苗候选基因LA3744的克隆表达和筛选鉴定表l扩增相应基因所用的引物基因引物内切酶LA3744F:gcccatggCGGAACCGAGTAATCAAGTCAAR:cgctceAGTTTCATAATCAAAAAAACAANcolXhol实施例1新的疫苗候选基因LA3744的克隆表达和鉴定通过常规分子生物学方法克隆表达LA3744基因，表达载体为pET28b+，表达菌株为E.coliBL21-3E，Kan抗性筛选阳性克隆后，加入LB液体培养基中，37°C250rpm扩增过夜。按1:100的接种量转至LB培养液，37匸培养2.5hr至OD约为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，30°C250rpm8hr诱导蛋白表达。超声粉碎已表达蛋白的E.coliBL21-3E细胞，收集沉淀。按照Qiagen公司提供的方法由Ni-NTA亲和层析，收集含重组蛋白的组分，并进行透析复性。PCR扩增产物、重组质粒的酶切鉴定及纯化蛋白的结果分别见图1、图2和图3所示。将重组蛋白进行SDS-PAGE电泳所得条带，用1%乙酸完全脱色后，用碳酸氢铵溶液冲洗，然后用8pg/ml胰蛋白酶消化8小时。冻千法回收肽段，重悬于2ml含有10mg/mLa氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)的50%乙腈(CAN)/0.1%三氟乙酸(TFA)溶液中。取0.7ml点靶进行MALDI-TOF/TOF生物质谱鉴定，应用肽混合物的肽质量指纹谱(Peptidemassfingerprinting，PMF)分析结果，应用Mascot(http:〃www.matrixscience.com)搜索弓|擎在NCBInr数据库中进《亍检索。与LA3744基因编码蛋白有非常高的匹配度(图4)。说明所纯化的蛋白正是目的蛋白。实施例2重组蛋白质的免疫原性检测400昭重组蛋白加等体积完全弗氏佐剂(Sigma公司)免疫3kg新西兰兔，PBS+佐剂为阴性对照组，初次免疫后每间隔15天用20(Vg重组蛋白加等体积不完全弗氏佐剂加强一次，加强两次后第10天采血，ELISA测其效价。重组蛋白PL40产生抗体效价大于1:16000。，显示有良好的免疫原性。Western-blot检测重组蛋白的免疫反应性，显示制备的多克隆抗体可以有效的和相应的重组蛋白妙A5口口o实施例3LA3744及其编码蛋白在中国钩体流行株中保守性检测在核酸水平的保守性检测以15株中国流行株和双曲螺旋体总DNA为模板，保守区域设计引物进行PCR扩增，在其中14株中都有特异的扩增条带产生，而卫氏钩端螺旋体清水型L105株和非致病性双曲钩端螺旋体中无特异性条带产生(图5)。在蛋白质水平的保守性检测以PL40抗血清进行Westernblot检测其在中国流行的15个血清群代表株的表达情况。有14株都能检测出相应杂交条带，分子量大小与理论值相符，表明都有该蛋白质表达，而卫氏钩端螺旋体清水型L105株和非致病性双曲钩端螺旋体中未检测出相应条带(图6)。PCR检测结果与western检测结果是完全一致的。本发明中所用中国流行的15个血清群代表株<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*中国药品生物制品检定所菌号实施例41、FACS检测疫苗候选抗原是否为钩端螺旋体表面暴露蛋白质以正常^fe血清为空白对照，LipL31免疫兔所得抗血清作为阴性对照，LipL32和LipL41免疫兔所得抗血清作为阳性对照，FACS检测疫苗候选抗原是否为钩端螺旋体表面暴露蛋白质结果如图7所示。图中灰色峰图为anti-rabbitLipL31血清与钩端螺旋体细胞的检测结果，白色峰图为特异性外膜蛋白抗血清与钩端螺旋体细胞的检测结果。每一次检测的荧光平均值(mean)见表2。对其进行student-t检验，均以PO.05为显著性差异，分析疫苗候选抗原免疫兔抗血清与阴性对照荧光信号的平均值是否有统计学意义。结果显示已知的暴露于外膜的蛋白LipL32和LipL41及PL40的均值与正常兔血清的t检验PO.05，有统计学意义，而内膜蛋白LipL31的检验PX).05。说明PL40与LipL32和LipL41相似，能与抗体特异性结合，是表面暴露蛋白。表2.FACS检测疫苗候选抗原是否为钩端螺旋体表面暴露蛋白质样品Meanl]Vtean2Mean3LipUl16.7713.4532.98IipL32660.91858.46505.320.003083IipL41340.54254.46272.660.000567PL40225.18120.99209.500.007622、TritonX-114提取分离法亚细胞定位钩端螺旋体细胞用1%TritonX-l14溶解，离心去除不溶物，可溶部分进一步区分为有机相和水相。全细胞、沉淀、有机相和水相四部分在SDS-PAGE中分离，并用anti-PL40、anti-LipL32、anti-LipL31抗血清进行免疫印迹检测。LipL32是已知的外膜蛋白，而LipL31是已知的内膜蛋白，用做对照。如图8所示，LipL32，大部分存在于有机相中，少数存在于沉淀中，而LipL31仅存在于沉淀中。PL40与LipL32—样都是大部分存在于有机相中，说明这个蛋白也可能是存在外膜中的蛋白。实施例5感染钩体豚鼠、小鼠及金黄地鼠中重组蛋白抗体产生1、Westernblot检测结果以感染钩体14天豚鼠、小鼠及金黄地鼠血清为一抗，Goat-anti-mouseIgGHRP，goatanti-guineapigIgGHRP或goatanti-hamsterIgGHRP为二抗，均检出有特异发光条带。如图9所示，说明在钩体在感染小鼠、豚鼠、金黄地鼠后均有anti-PL40产生。2、ELISA检测结果在本发明中，分别以亚致死剂量低传代的钩端螺旋体赖型赖株腹腔注射小鼠、豚鼠或金黄地鼠，心脏取血采集0、7、14、和28天的血液。以0.3ug/ml重组PL40蛋白包被酶标板，进行ELISA检测。如图10所示，结果显示感染7天后的小鼠和地鼠血清中抗体滴度比正常血清高，而感染28天后抗体滴度显著增高。这个结果说明PL40蛋白是钩端螺旋体感染过程中的主要免疫原性蛋白。因此，PL40蛋白不但可以作为钩端螺旋体的疫苗候选基因，而且可在钩体病的检测中发挥作用。根据钩端螺旋体全基因组注释，LA3744长1074bp，编码蛋白含有357个氨基酸，预测其分子量为39.0KD，结合重组蛋白电泳结果，我们将其编码蛋白命名为PL40。TMHMM进行二级结构预测表明该蛋白在C-端为跨膜结构域，其余部分主要为膜外域，BLASTN和BLASTP软件分析发现，除了钩端螺旋体，在其它生物中并未发现LA3744类似序列。在已完成测序的3株致病性钩端螺旋体中，LA3744的序列非常保守，与哥本哈根型FiocruzLl-130株相似性分别为99%，与另两株博氏螺旋体的相似性也高达90%。在腐生型双曲钩端螺旋体也有LA3744的同源序列，但相似性很低，仅为37%。以LA3744的全长引物进行PCR从基因水平检测了PL40在中国流行的15个血清群代表株中的保守性。结果显示除卫氏螺旋体清水型与非致病性双曲钩端螺旋体外，其他14株菌中均检出有特异性条带。这一结果说明，PL40可能在这两株菌中没有同源基因的存在。这个结果也通过Westernblot方法在蛋白质水平得到确认，仅此两株菌没有PL40。免疫荧光法、TritonX-114抽提法及FACS方法均证实PL40蛋白是钩端螺旋体赖型赖株的表面暴露蛋白质，与LipL32相似，存在于外膜中。由前面的实验我们发现PL40蛋白是一个新发现的、在致病钩端螺旋体中保守的表面暴露的蛋白，但其是否在钩端螺旋体感染人体时表达是决定其能作为有价值的诊断抗原和疫苗候选蛋白的关键。致病性钩体感染哺乳动物宿主后，只有表达的细菌抗原，才能成为宿主免疫系统识别的靶位点。由于啮齿动物是致病性钩端螺旋体主要的传染源和存储宿主，在研究钩端螺旋体感染哺乳动物，我们选用了小鼠、金黄地鼠和豚鼠作为钩端螺旋体的感染宿主研究PL40蛋白在哺乳动物体内表达及抗体产生的情况。小鼠作为持续性无症状感染的动物模型，钩体感染小鼠后，一般没有明显的不利影响，亦不引起急性发病，但钩体在小鼠肾脏内长期定居，并不断繁殖，随尿液排出体外。而金黄地鼠和豚鼠则是致病性钩体的易感宿主，幼龄豚鼠和金黄地鼠感染钩体后会出现典型黄疸、肺出血、肝脾损伤等症状，死亡率极高。大量的免疫保护实验以及致病机制的研究中都把它们作为急性感染的动物模型。在本试验中研究中发现，在感染钩端螺旋体的小鼠、豚鼠和金黄地鼠血清中都能检出PL40抗体，第7天开始就可以明显检出有PL40抗体产生，随着时间延长，血清中其抗体滴度逐渐增高，第28天时抗体的滴度明显高于第7天。这一结果说明当致病性钩体56601株感染哺乳动物时，有PL40蛋白表达且有抗体产生。并且推测这个蛋白可能在钩体致病中发挥作用。由于其在致病株中具有高度的保守性，同时其为钩端螺旋体中的特有蛋白，因此是一个非常有价值的诊断抗原和疫苗候选蛋白。SEQUENCELISTING<110>上海交通大学医学院<120>钩端螺旋体疫苗候选的外膜蛋白<130〉/<160>2〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉357<212>PRT<213>Leptospirainterrogans(钩端螺旋体)<400>1MetGluProSerAsnGinValAsnLysLeuGinGluGinAlaAsnLeu151015MetAsnLeuAlaLeuGluSerValLeuThrGluGluGinAlaValGlu202530LeulieGinGlyLyslieArgAspAlaTyrLeuLeuLyslieArglie354045AsplieGluAsnArgSerGlyAlaValValAlaLeuValThrLysTyr505560LysAsnGluVallieGluliePheSerLeuPheSerAsnSerSerLeu65707580lieArgLyslieArgSerPheGinAspSerAlaAlaPheAlaLeuAsp859095MetValGluAlaAlaLysSerGluProTyrAspProGlyLeuSerAsp100105110SerlieGlyArglieValTyrSerLysLeuThrLysAlaValLeuGlu115120125SerSerTyrAlaAsnTrpAspLysAsnAspAlaSerSerLeuValAsn130135140lieLeuGluAsnGinlieLysThrSerLeuLysValAsnlieValArg145150155160lieGinAlaAspValGluPhelieSerSerLeuLysPheArgValLys165170175AsnValPheThrGlylielieProThrValAsnArgProValGluGlu180185190ProSerlieGlyGinValProGluSerGinGluLysThrProValGin195200205ArgGinlieAspGinPheArgLysProPheGlyArgVallieLeuSer210215220LysThrValLeuAlaProValGlyGlyValAspPheAspGluLeuThr22523023524021GluGlyAspArgLeuTyrPheGinLeuProThrGlySerMetAspGlu245250255LysAlaMetAlaLysThrLeuGlyGlylieAspGluAspGlyAsnVal260265270ArgAsnValValGlyGluPhelieGlylieAlaAlaGlyLysGlyGlu275280285TyrHisliePheAlaLysGlyProSerGlyValLeuLeuGinAlaPhe290295300GluGluArgProValArgLeuAlaLysValLysThrLysThrSerSer305310315320SerAlaSerThrThrLysThrGluThrSerSerGlyGlyGlySerLeu325330335GlylielielieValAlaGlyValValLeuValValGlyLeuLeuVal340345350PheLeulieMetLys355<210>2<211〉1074<212>腿<213>Leptospirainterrogans(钩端螺旋体)〈400〉2atggaaccgagtaatcaagtcaataaattacaggaacaagcgaatcttatgaatcttgcg60cttgaatctgtacttacggaagaacaagcggtagaattaattcagggtaagattagggac120gcttatcttttaaaaatcagaatcgatattgaaaatagaagtggcgccgtggtcgcttta180gtgactaagt3t犯犯acgaiagtcataga^attttttccttattttctaattcgtctttg240atccgtaaaattcgaagttttcaagattctgctgcatttgcattagatatggtagaagca300gcaaaatcggaaccatatgatccggggctttctgatagcattggaaggatcgtctattct360aaactcaccaaagctgtattagaatcttcttatgcgaactgggataaaaacgacgcttct420agtctcgtaaatattttagagaatcaaattaaaacatcattaaaagtgaatattgttcgg480attcaagcggatgtagaatttatatctagtttaaaatttagagttaaaaacgtttttact540ggaattattcctacggtcaatcgtcctgttgaagaaccttctattggtcaagttcctgaa600agccaagaaaaaactccggttcaaagacagatcgatcaatttagaaaaccttttggaaga660gtgattctttctaagacggttcttgctcctgttggaggagttgattttgacgaattgacg720gaaggagacagactttattttcaactacctactggaagtatggatgaaaaggcgatggca780aagacgttaggtggtatcgacgaagacgga犯cgtaagaaacgtagtgggtgagtttatc840ggaatcgccgccggaaaaggagaataccatatttttgccaaaggtccttccggggttctt900ttacaggcgtttgaagaacgccccgtccgacttgcaaaagtaaaaactaaaacttcaagt邻Otctgcctcaactactaaaaccgaaacttcttccgggggaggttcccttggaattattatc1020gttgcaggtgtggtacttgtagtgggtttacttgtttttttgattatgaaataa107权利要求1.一种分离的钩端螺旋体外膜蛋白多肽，其特征在于，它包含具有选自SEQIDNo1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQIDNo-1的氨基酸序列的多肽。3.—种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQIDNo:l所示氨基酸序列的多肽。5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组(a)具有SEQIDNo:2中的序列。6.—种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。7.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。8.—种钩端螺旋体外膜蛋白多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达钩端螺旋体外膜蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞(b)从培养物中分离出钩端螺旋体外膜蛋白多肽。9.一种能与权利要求1所述的钩端螺旋体外膜蛋白特异性结合的抗体。10.—种疫苗组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。全文摘要本发明提供了可作为候选疫苗的钩端螺旋体外膜蛋白，编码外膜蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这类外膜蛋白的方法。外膜蛋白是一种有用的制备疫苗的免疫原。本发明还公开了这类蛋白及其编码序列用于制备疫苗的用途。文档编号C12N1/21GK101544689SQ200910050588公开日2009年9月30日申请日期2009年5月5日优先权日2009年5月5日发明者平何,朱泳璋,杨宏亮,秦金红,蔚赵,郭晓奎,陈春燕申请人:上海交通大学医学院