专利名称：一种腈水解酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶学领域，具体地说，涉及一种微生物来源的腈水解酶及其制备方法 和应用。
背景技术：
腈水解酶是一种具有广泛底物适应性的生物催化剂，可以催化腈水解生成相应的 羟基酸。由于天然腈化物的广泛存在，使很多微生物都或多或少具有降解腈化物的能力。目 前已有多种微生物来源的腈水解酶被报道，其反应底物多种多样，具体如以下表1所示表1、用于制备腈水解酶的菌株及其对应的水解底物 3-羟基丁酸俗称β _羟基丁酸，英文名称为3-hydroxybutyric acid或 DL-β -hydroxybutyric acid，其分子式为 C4H8O3,分子量 104. 10，CAS 号为 625-71-8，结构 式
3-羟基丁酸有两种构型的对映体，分别为(R)-3-羟基丁酸[CAS 625-72-9]和 (S)-3-羟基丁酸[CAS 6168-83-8]。3-羟基丁酸在医药领域中的用途广泛，例如(R)-3-羟基丁酸不仅可用于治疗癌 症、糖代谢紊乱等疾病，还具有抑制酮体水平异常提高，减少自由基伤害，加强代谢效率等 功效(W02004108740)。同时，在可降解塑料合成中，3-羟基丁酸也有应用价值，例如，以其 为基础可得到3-羟基脂肪酸，进而制备具有生物可降解性和生物相容性的热塑性材料聚 羟基脂肪酸酯(PHB)。因此，制备3-羟基丁酸具有重要意义。但现有工艺中，制备3-羟基丁酸主要通过化学方法，如β-丁内酯的水解、 Reformatsky反应、还原法、丁烯酸水合制备、萘锂催化剂制备以及水解法或氧化法等方法 制备，但采用上述化学法具有以下不足合成工艺复杂，反应条件比较苛刻，对设备要求高， 金属催化剂价格昂贵，易造成污染，对环保不利等。而生物法催化腈水解副产物少，反应条件温和，但目前发现的腈水解酶中还没有 哪一种酶能够水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。
发明内容
本申请的发明人在长期的研究中，找到了一种微生物来源的新的腈水解酶，其能 够水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。因此，本发明的首要目的就在于，提供一种微生物来源的腈水解酶。本发明还有一个目的在于，提供所述腈水解酶的制备方法。本发明还有一个目的在于，提供所述腈水解酶的应用。 本发明提供的腈水解酶的ν端的20个氨基酸序列为nh2-thpqfkaavvqaapvfl NLD。根据本发明，所述腈水解酶来源于Arthrobacter nitroguajacolicus菌的发酵产 物。本发明提供的腈水解酶，通过发酵Arthrobacter nitroguajacolicus菌而获得。本发明提供的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。本发明提供了 一种新的腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸， 且反应的水解副产物少，反应条件温和，时空产率高。此外，由于3-羟基丁腈的水溶性好， 因此水解反应可以在纯水相中进行，有利于酶的稳定，因而具有很高的工业化生产潜力。
图1是上层粗酶液和放置8h后的上层粗酶液进行电泳检测的检测结果，其中，泳 道1为直接检测的结果，泳道2为放置8h后的检测结果。图2是经苯基疏水柱纯化后P3-P7号接收段溶液及粗酶液的蛋白质电泳检测结 果，其中，泳道1-5分别为P7-P3号接收段的检测结果，泳道6为粗酶液的检测结果。
图3是经丁基疏水柱纯化后B2号接收段溶液的蛋白质电泳检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。UT 1^M r^, PfiM W^tt Arthrobacter nitroguajacolicus, BT 2008
3月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为 CGMCCNo. 2405。以下实施例中，用于发酵培养 Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 菌株的培养基配方如下斜面培养基(wt%)葡萄糖 1. 0%、酵母膏 0. 3%、NaCl 0.1%, K2HPO4 ‘ 3H20 0. 02%,MgSO4 · 7H20 0. 02%,琼脂粉 2%。发酵培养基(wt%)葡萄糖 1.5%、蛋白胨 1.0%、MgSO4 · 7H20 0.05%, KH2PO4 0. 05%,K2HPO4 ·3Η20 0. 05%、谷氨酸纳 0. 075%、半胱氨酸盐酸盐 0. 015%、苯甲腈 0. 025% (体积)，ρΗ7· 0。以下实施例中，酶活的检测方法如下1体积的酶液加1/20体积的丙烯腈(99. 0% )，反应1小时后加入盐酸终止反应，
气相色谱分析产物丙烯酸含量。酶活单位定义1毫升酶液反应1小时产生1个ppm的酸为1个单位。以下实施例中，测定水解产物3-羟基丁酸的含量的方法采用高效液相色谱法，具 体如下检测条件色谱柱为150mmX4. 6mm,不锈钢柱，内装Kromasil ODS C18、5u的填 充物；流动相为磷酸二氢钠缓冲液乙腈=95 5(V/V)；流速为0. 5ml/min ；检测波长为 2IOnm ；柱温为30°C ；进样量为20 μ L。检测方法称取3-羟基丁酸标准品0. Ig,置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇 勻。称取约含3-羟基丁酸0. Ig的样品，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇勻。在上述色谱条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准品溶液，待相邻两针标准品 溶液峰面积的响应值变化小于1.0%时，按照标样、样品、样品、标样的顺序进行测定。将测 得的两针样品以及前后两针标样的峰面积进行平均。试样的质量分数按以下公式计 算 其中，A1为标准品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；A2为样品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；Hi1为称取3-羟基丁酸标准品的质量，g ；m2为称取试样的质量，g ；P为标准品中3-羟基丁酸标准品的质量分数，％。实施例1、发酵菌株培养及发酵液检测
1. 1、发酵菌株培养挑取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405，接种至斜面培养基，于 28°C培养4天；然后，从斜面挑取培养好的菌株，转移到发酵培养基中，于220rpm、28°C培养 4天，获得发酵液。1.2、酶液稳定性检测取步骤1. 1获得的发酵液25ml，浓缩5倍，使用10mM Tris-HCl缓冲液进行细胞悬 浮，并进行细胞破碎，细胞破碎条件如下超声2秒、间歇5秒、功率700 800W、时间0. 5小时。破碎后的细胞溶液于15000rpm离心30 40分钟，收集上层粗酶液。将收集到的离心上清放置8h后，进行蛋白质电泳检测，同时以未经放置的离心上 清作为对照，检测结果如图1所示。图1的检测结果显示，随着放置时间的延长，酶液中分子量约30kDa的蛋白质增 加，而分子量大于30kDa的蛋白质减少，上述结果说明破碎细胞后获得粗酶液中的目标蛋 白不稳定、易降解，降解后的单体的分子量约为30kDa。然后，采用上述方法，分别检测了该酶在HEPES、磷酸钾缓冲液等多种缓冲体系中 的稳定性，结果显示在高浓度磷酸钾缓冲体系中，此酶稳定性较好。因此，在下述发酵液进行预处理时，使用0. 5M pH7. 2的磷酸钾缓冲液(含ImM DTT)进行细胞悬浮。1.3、发酵液预处理将步骤1. 1获得的发酵液浓缩5倍，然后使用0. 5M pH7. 2的磷酸钾缓冲液(含 ImMDTT)进行细胞悬浮，并进行细胞破碎，细胞破碎条件如下超声2秒、间歇5秒、功率700 800W、时间1 1. 5小时。破碎后的细胞溶液于15000rpm离心30 40分钟，收集上层粗酶液。实施例2、蛋白纯化将实施例1中获得的上层粗酶液进行饱和硫酸铵分级沉淀，并收集0 35%饱和 度下的沉淀。然后，用0. 5M pH7. 2磷酸钾缓冲液溶解粗酶沉淀，将获得的粗酶液经苯基疏水柱 纯化，并收集洗脱液，同时检测洗脱液的酶活和蛋白含量，再将收集到的比酶活较高部分使 用丁基疏水柱纯化，具体纯化条件如下1、苯基疏水柱(Phenyl_650C)柱床高12cmX 直径 1cm，体积 9. 4ml ；流速0.lml/min 吸附、lml/min 洗柱(0. 5M 磷酸钾缓冲液，pH7. 2)、0. lml/min 洗 脱(去离子水)；上柱量2ml (6. 42mg/ml)。以1. 5 2ml为一个接收段，并以A280来监测蛋白质洗脱的过程，在测完每段接 收液的A280值后等体积加入1M、pH7. 2磷酸钾缓冲液。在接收了约6ml液体后，A280较空白对照明显上升，将A280明显上升的几段接收 液浓缩后检测蛋白质含量和酶活，检测结果如表1所示，其中，P0为上柱前的粗酶液，P2-P7 为A280明显的几段接收液。
6
表1、苯基疏水柱纯化后接收段及粗酶液蛋白含量及酶活检测结果 根据表1的结果，将P0以及P3 P7号接收段溶液进行蛋白质电泳检测，电泳结 果如图2所示，根据检测结果，将比酶活较高的两段接收液P4和P5合并。重复苯基疏水柱纯化步骤，以获得足够用于丁基疏水柱纯化的接收液，然后使用 丁基疏水柱纯化，具体纯化条件如下2、丁基疏水柱(Butyl_650C)柱床高12cmX 直径 lcm,体积 9. 4ml ；流速0.lml/min 吸附、lml/min 洗柱(0. 5M 磷酸钾缓冲液，pH7. 2)、0. lml/min 洗 脱(去离子水)；上样量1ml(3. 12mg/ml)。以约1. 5ml为一个接收段，以A280来监测蛋白质洗脱的过程，在测完每段接收液 的A280值后等体积加入1M、pH7. 2磷酸钾缓冲液。在接收了约6ml液体后，A280较空白对照开始有所上升，将A280明显的几段接收 液浓缩后检测蛋白质含量和酶活，检测结果如表2所示，其中，B0为上柱前的酶液，B1 B6 为A280明显的几段接收液。表2、丁基疏水柱纯化后接收段及粗酶液蛋白含量及酶活检测结果 根据表2的结果，取B2段接收液进行蛋白质电泳检测，电泳检测结果如图3所示。上述结果显示上完第一根苯基疏水柱后的比酶活较高的酶液仍能在30 40kDa 范围里看到明显的大于30kDa分子量条带；而上完第二根丁基疏水柱后，收集到的酶液中 仅见到分子量近30kDa的小分子量条带。实施例3、蛋白检测将实施例2中经丁基疏水柱纯化获得的酶进行N端测序，检测结果显示，该酶的N 端二十个氨基酸的序列为Mi-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD(由于该酶是经降解获得的，因此其N 端第一个氨基酸不是氨基酸M)。然后，将测定序列进行Blastp比对，比对结果如表3所示，其中，标注有*的蛋白 质序列归类为EC3. 5. 5. 1，未标注*的蛋白质序列归类为EC3. 5. 5. 7。表3、Blastp比对结果 表3的比对结果显示，实施例2中获得的酶与腈水解酶的氨基酸序列具有很高的 同源性，其中，与该酶同源性最高的腈水解酶(即NCBI蛋白质序列号为AAR97492的腈水解 酶)的序列和该酶相比，自氨基酸T开始只有两个氨基酸不同。用Vector软件(购自Invitrogen公司)将此序列与已有报道的序列(从NCBI GeneBank中获得)比对，其序列与多个腈水解酶序列(表3中的下划线部分)有较高的同 源性。根据上述结果，上述实施例中获得的酶与现有的腈水解酶具有较高的同源性，是 一种新的腈水解酶。实施例4、水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸按照实施例2的方法制备腈水解酶，测得其酶活95180，将此酶用于水解3-羟基丁 腈，具体过程如下取300 ill酶液，加入3-羟基丁腈至终浓度为1 %，30°C反应20小时，然后，检测获 得的3-羟基丁酸含量，根据检测结果，生成的3-羟基丁酸的含量为0. 96%。根据上述结果，本发明获得的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸， 且反应条件温和，此外，由于3-羟基丁腈水溶性好，反应可以在纯水相中进行，因而可用于 工业化生产。综上所述，本发明提供了一种新的腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产 3-羟基丁酸，且具有很高的工业化生产潜力。
权利要求
一种微生物来源的腈水解酶，其特征在于所述腈水解酶的N端的20个氨基酸序列为NH2-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD。
2.如权利要求1所述的腈水解酶，其特征在于所述腈水解酶来源于Arthrobacter nitroguajacolicus W^MWl^^Jo
3.如权利要求2所述的腈水解酶，其特征在于所述Arthrobacter nitroguajacolicus 菌的保减号为 CGMCC No. 2405。
4.如权利要求1 3中任一项所述的腈水解酶的制备方法，其特征在于所述方法包 括对Arthrobacter nitroguajacolicus菌进行发酵以获得腈水解酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述Arthrobacternitroguajacolicus菌 的保藏号为CGMCC No. 2405。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于用于发酵的培养基的配方如下葡萄糖 1. 5wt%，蛋白胨 1. 0wt%,MgS04 '7H20 0. 05wt%,KH2P04 0 . 05wt%,K2HP04.3H200. 05wt %，谷氨酸纳0. 075wt %，半胱氨酸盐酸盐0. 015wt %，苯甲腈0. 025 % (体积)， pH7. 0。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法还包括对发酵液进行固液分离以 及对固液分离获得的细胞进行破壁的步骤。
8.如权利要求1 3中任一项所述的腈水解酶的应用，其特征在于用于水解3-羟基 丁腈生产3-羟基丁酸。
全文摘要
本发明公开了一种微生物来源的腈水解酶及其制备方法和应用。本发明提供的腈水解酶，其N端的20个氨基酸序列为NH2-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD。本发明提供的腈水解酶可以通过对Arthrobacter nitroguajacolicus菌进行发酵而获得。本发明提供的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，反应的水解副产物少，条件温和，时空产率高，此外，3-羟基丁腈水溶性好，反应可以在纯水相中进行，有利于酶的稳定，因而具有很高的工业化生产潜力。
文档编号C12N9/78GK101875927SQ20091005013
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者唐璐敏, 张仙, 朱健, 李还宝, 杨巍, 薛建萍, 郝婷婷 申请人:上海市农药研究所;薛建萍