专利名称：一种尼克酸生物学制备方法、相关的菌株及其腈水解酶诱导方法
技术领域：
本发明涉及微生物学技术领域，更具体地，涉及利用微生物制备尼克酸的技术领 域，特别是指一种尼克酸生物转化制备方法、相关的菌林及其腈水解酶诱导方法。
背景技术：
尼克酸，化学名称为吡啶3-甲酸，又名烟酸，结构式为、w^ ，英文名为
3-pyridine carboxylic acid或nicotinic acid ,俗-尔维生素B5，属维生素B;J矣，与尼克酰 胺一起称维生素pp。尼克酸主要存在于动物的肝脏、肾、肌肉、酵母、麦麸、米糠、 花生、水果和蔬菜中，含量不等，约在0.7 4卯mg/kg之间。外观为白色或微黄色晶 体或者结晶粉末，其无臭，1。/。水溶液的pH为3.0 ~ 4.0。其分子量123.11,密度为 1.473g/cm3，熔点234 237。C, lg尼克酸可溶于60ml水中，易溶于沸水和碱溶液中， 不溶于醚和脂类有机溶剂。最大吸收波长263nm，等电点4.23 ~ 4.25。尼克酸是所有 维生素理化性质中最稳定的一种，不容易被酸、碱、水分、金属离子、热、光氧化剂 及加工贮存等因素破坏，毒性小，LD50=5OOO ~ 7000mg/kg。
尼克酸是一种动物所必需的化学物质，它参与有机物的氧化还原作用，促进新陈 代谢，可以用来治疗皮炎和神经障碍，在日常生活中被广泛应用，其主要应用有
1) 食品添加剂尼克酸在人体内有维持皮肤和神经健康、促进消化道功能、扩 张血管的作用。人体缺乏尼克酸会发生口炎、舌炎、记忆力减退、精神抑郁和肠炎腹 浮等症状。尼克酸可以由肠内细菌合成或者由体内的色氨酸生成， 一般不易发生尼克 酸缺乏症。但是，当以不含尼克酸的食品为主食，或者主食中含有尼克酸代谢抵抗物 质时，容易发生因缺乏尼克酸而引起的粗皮肤病。在食品中添加适量的尼克酸，可以 有效预防缺乏尼克酸而引起的各种病症。人体每日对尼克酸的需求量为成人10-20mg,婴儿4 llmg。尼克酸在食品中的添加量为改质奶粉40mg/kg,面粉35~ 44mg/kg,面条55 ~ 75mg/kg，面包22mg/kg,玉米4分35 ~ 53mg/kg。
2) 祠料添加剂在谷物祠料中，尼克酸主要是以结合形式存在的，不能直接被 动物吸收，因此目前世界上普遍在饲料中添加人工合成尼克酸。3) 医药中间体尼克酸是合成烟酰胺的重要原料，还可以用来合成尼克刹米、 尼克酸肌醇等一 系列药物。尼克刹米可以用来治疗呼吸以及循环系统衰竭症；尼克酸 肌醇是用来治疗高血脂的药物。随着国内外科技和经济水平的不断提高，以尼克酸为 中间体生产的药品达十多种，可用于治疗肠胃病，吸血虫病，循环系统失调，舌炎， 高血压，高胆固醇、心脏病和中风等。尼克酸本身可以预防皮肤病和类似的维生素缺 乏症，具有扩张血管作用，对高血脂糖尿病等有明显疗效。而且，尼克酸及其衍生物 用于戒烟，可使用不同的给药方式，安全、可靠。
4) 活性染料近二十年来，尼克酸在染料工业中的应用受到重视，成为合成多 种活性染料和偶氮染料的中间体。含有尼克酸的活性染料能与纤维素上的烃基反应， 从而使纤维的染色能够持久。并且含有尼克酸的活性染料使用范围广泛，勾染性很好。
5) 日用化学工业品尼克酸用作染发助剂，可以改善染发效果，此外尚可用作 头发生长促进剂。
6) 尼克酸的其他用途尼克酸在食品工业中，可作去味剂或保色剂，在蔬菜保 存中作保鲜剂。此外，它还是重要的化工助剂和緩蚀抑制剂，也可作为对光敏感的合 成树脂的光稳定剂、PVC塑料的热稳定剂、丙烯酰胺聚合的链转移剂等。
目前，工业上生产尼克酸的方法有硝酸氧化法、高锰酸钾氧化法、氨氧化法、电 解氧化法、喹啉氧化法等等，但是这些传统的化学工业方法通常需要采用强酸(强碱)、 高温、高压等反应条件，工艺复杂，安全性差，环境污染严重，而且副产物多，转化 率低。
因此，需要发明一种新的尼克酸生产方法，其生产安全简便，不污染环境，且副 产物少，甚至没有，转化率高。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种尼克酸生物学制备 方法、相关的菌林及其腈水解酶诱导方法，该尼克酸生物学制备方法生产安全简便， 不污染环境，且无副产物，转化率高。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种产睛水解酶浑球红细菌 (Rhodobacter sphaeroides ),所述产睛水解酶浑球红细菌的保藏编号为CCTCC M209065。
所述的浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的分类命名为浑球红细菌LHS-305 (Rhodobacter sphaeroides LHS-305 ),是从土壤中自然筛选得到的野生菌林，该菌抹提交中国典型培养物保藏中心(地址武汉市武昌珞珈山)保藏，其保藏日期为 2009年4月3日，保藏号为CCTCC M20卯65。 所述的浑球红细菌的细菌学特性为
1、 形态特征
(1 )细胞的形态杆状
(2) 孢子的形成无
(3) 芽孢无
(4) 革兰氏染色性 阴性
2、 在LB琼脂培养基上的生长形态(30°C, 48h): 菌落形状圆形(circular);
菌落表面隆起扁平状(flat)，中央有小隆起(hunch); 大小1 ~ 2mm;
色调淡黄色；. '
3、 LB液体培养基生长状态(30°C)
繁茂生长，形成菌膜，中度混浊，随着生长形成沉淀。
在本发明的第二方面，提供了一种腈水解酶诱导方法，其特点是，培养上述的产 睛水解酶浑球红细菌，然后采用腈水解酶诱导物进行诱导。
可以诱导浑球红细菌产腈水解酶的诱导剂可以是任何一种适合于此目的的物质。 较佳地，所述腈水解酶诱导物为3-氰基吡啶、3-氰基吡啶结构类似物、短链脂肪腈类 化合物、短链脂肪酰胺化合物、芳香类酰胺化合物、芳香羧酸类化合物、短链脂肪羧 酸类化合物或尿素。典型的对本发明合适的诱导剂是腈、酰胺和羧酸。
更佳地，所述腈水解酶诱导物选自下列化合物I ~ IX的一种或几种
<formula>formula see original document page 6</formula>[I];
<formula>formula see original document page 6</formula>[II];更进一步地，Ri为H、 CH3、 OH、 OCH3、 Cl、 F、 CN、 NH2ilN02， R2为H、 CH3、 OH、 OCH3、 Cl、 F、 CN、丽2或冊2。
更佳地，所述3-氰基吡啶结构类似物为苯曱腈；所述短链脂肪腈类化合物为2 6 个碳原子的腈类化合物；所述短链脂肪酰胺化合物为2 6个碳原子的脂肪酰胺类化合 物；所述芳香类酰胺化合物为尼克酰胺或苯乙酰胺；所述芳香羧酸类化合物为尼克酸； 所述短链脂肪羧酸类化合物为2 ~ 6个碳原子的脂肪羧酸类化合物。
对浑球红细菌已经实验证实有效的腈水解酶诱导物包括如下例子乙腈，丙烯 腈，尿素，3-氰基吡啶，尼克酰胺，尼克酸，苯曱腈，苯曱酰胺，苯甲酸，苯乙酰胺。 诱导物的种类决定了酶量的大小，其中乙腈的诱导效果最好，诱导产酶量明显高于其 它任何一种诱导物。浑球红细菌不用诱导剂亦可产酶，只是酶量低于使用诱导剂的效 果。浑球红细菌微生物的培养可以在 一 般性丰富培养基以及任何适宜的条件下进 行，培养过程中可加入少量诱导剂，有利于后续的诱导过程产酶，所述培养的温度为 20~ 37°C。
浑球红细菌微生物的产腈水解酶的过程需要加入诱导剂诱导，将种子培养基生长 的菌液转接于诱导培养基中，使腈水解酶在细胞内聚集。较佳地，所述腈水解酶诱导 物的浓度为l ~ 200mM。
在本发明的第三方面，提供了一种尼克酸生物学制备方法，其特点是，将上述的 产腈水解酶浑球红细菌或其产腈水解酶的突变林与3-氰基吡啶混合后转化生成所述 尼克酸；或者将经上述的经诱导的浑球红细菌或其产腈水解酶的突变抹与3-氰基吡啶 混合后转化生成所述尼克酸。
转化过程中，腈水解酶存在的緩冲体系可以是任意一种适宜于转化过程的体系， 其pH为6 ~ 8 ,緩沖剂的浓度为20 ~ 200mM ,最好为NaH2P04/Na2HP04或者 KH2P04/K2HPCMi冲体系。转化过程的温度可以是20 ~ 40。C中任何适宜的温度，较佳 地，所述转化的温度为20 37。C，更佳地，所述转化为摇瓶转化，所述摇瓶转化的温 度为30'C。其中选择37。C为最佳。
本发明的有益效果在于本发明采用在金属离子存在条件下培养的浑球红细菌经 腈水解酶诱导物诱导后与3-氰基吡啶混合转化生产尼克酸，即采用微生物静息细胞催 化制备尼克酸，无需采用强酸(强碱)、高温、高压等反应条件，生产安全简便，无 任何副产物，不污染环境，底物转化率可达到95%。
具体实施例方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。 测定腈水解酶活性的方法和下列实施例中酶活力的单位特定义如下 (1 )测定腈水解酶活力的方法
在pH7.0的50mM的NaH2PCVNa2HPO4緩沖体系中，以10mM的3-氰基吡啶为底 物，0.005g/ml (干重)的静息细胞浓度下，30。C下震荡20min,迅速取样离心，采用 文献Journal of Molecular Catalysis(B): Enzymatic 29(2004)227 ~ 2327厶开的HPLC方法
检验生成的尼克酸的量。 (2)单位的定义
l单位(lU)腈水解酶活力的定义为lg菌体(干重)在上述条件下，催化3-氰基吡 啶生成尼克酸的量(mmol)。实施例l浑球红细菌体的培养
取浑球红细菌的冻干管藏菌种，接种于LB琼脂斜面上培养，30。C培养24h,待斜 面上长出菌落，取少量于种子液体培养基中，30。C培养24h。
种子培养基成分(pH最终调整为6 8):
成分剂量(g/L)
酵母膏
蛋白胨
K2HP04
NaCl1
FeS040.03
甘油3.3
MgS040.2
实施例2腈水解酶的诱导
取一定量的实施例l中培养的菌液，接种于诱导培养基中，同时加入适量诱导物， 30。C诱导24h,离心收集菌体，用pH7.0的NaH2PCVNa2HPO4緩冲液洗涤细胞两次，再 用适量緩冲液悬浮。
诱导培养基(pH最终调整为6 8):
成分剂量(g/L)
甘油3.3
KH2P042
NaCl1
MgS040.2
FeS040.03
诱导过程中诱导物的浓度为10mM，诱导过程的条件与培养种子时相同，不同诱 导物的诱导效果如下表所示(市售，AR)酶活力(U)菌体量(干重 g/ml)
3-氰基吡啶10.90.0024
尼克酸9.80.0012
乙腈29.10.0022
丙烯腈17.30.0021
苯乙酰胺28.80.0024
无9.00.0033
尿素6.90.0017
尼克酰胺10.70.0025
苯曱腈18.00.0022
苯乙酸10.00細3
苯乙腈2.70.0004
丙烯酸8.00.0015
苯曱酸7.90.0003
实施例3尼克酸的生物学制备
将lM的3-氰基吡啶加入到实施例2制备的采用10mM乙腈诱导的0.018g/mK干重) 悬浮的静息细胞中，使其终浓度为0.25M, 30。C摇瓶中转化16h,采用文献Journal of Molecular Catalysis(B): Enzymatic 29(2004)227 ~ 232公开的HPLC方法检验生成的尼 克酸的量，其底物生成尼克酸的转化率为95%。
实施例4尼克酸的生物学制备
将lM的3-氰基吡啶加入到实施例2制备的采用10mM3-氰基吡啶诱导的0.018g/ml (干重)悬浮的静息细胞中，使其终浓度为0.25M， 30。C摇瓶中转化24h,采用文献 Journal of Molecular Catalysis(B): Enzymatic 29(2004)227 ~ 232公开的HPLC方法检验 生成的尼克酸的量，其底物生成尼克酸的转化率为95%。
实施例5尼克酸的生物学制备
将1M的3-氰基吡啶加入到实施例2制备的采用10mM3-氰基吡啶诱导的0.018g/ml (干重)悬浮的静息细胞中，使其终浓度为0.5M， 30。C摇瓶中转化24h,采用文献Journal of Molecular Catalysis(B): Enzymatic 29(2004)227 ~ 232公开的HPLC方法检验生成的尼克酸的量，其底物生成尼克酸的转化率为58%。
从以上具体实施例中可以看出，本发明的采用微生物静息细胞催化制备尼克酸， 无需采用强酸(强碱)、高温、高压等反应条件，生产安全简便，无任何副产物，不 污染环境，底物转化率可达到95%。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作 出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图
应被认为是说 明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种产睛水解酶浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，所述产睛水解酶浑球红细菌的保藏编号为CCTCC M209065。
2. —种腈水解酶诱导方法，其特征在于，培养根据权利要求l所述的产睛水解酶浑球 红细菌，然后采用腈水解酶诱导物进行诱导。
3. 根据权利要求2所述的腈水解酶诱导方法，其特征在于，所述腈水解酶诱导物为3-氰基吡啶、3-氰基吡啶结构类似物、短链脂肪腈类化合物、短链脂肪酰胺化合物、 芳香类酰胺化合物、芳香羧酸类化合物、短链脂肪羧酸类化合物、尿素或不使用 诱导物。
4. 根据权利要求3所述的腈水解酶诱导方法，其特征在于，所述腈水解酶诱导物选自 下列化合物I ~ IX的 一种或几种<formula>formula see original document page 2</formula><formula>formula see original document page 3</formula>[IX]。
5. 根据权利要求4所述的腈水解酶诱导方法，其特征在于，Ri为H、 CH3、 OH、 OCH3、 Cl、 F、 CN、 NH2或N02, R2为H、 CH3、 OH、 OCH3、 Cl、 F、 CN、丽2或戰。
6. 根据权利要求3所述的腈水解酶诱导方法，其特征在于，所述3-氰基吡啶结构类似 物为苯甲腈；所述短链脂肪腈类化合物为2-6个碳原子的腈类化合物；所述短链 脂肪酰胺化合物为2 6个碳原子的脂肪酰胺类化合物；所述芳香类酰胺化合物为 尼克酰胺或苯乙酰胺；所述芳香羧酸类化合物为尼克酸；所述短链脂肪羧酸类化 合物为2 ~ 6个碳原子的脂肪羧酸类化合物。
7. 根据权利要求2所述的腈水解酶诱导方法，其特征在于，所述培养的温度为20 37°C。
8. 根据权利要求2所述的腈水解酶诱导方法，其特征在于，所述腈水解酶诱导物的浓 度为1 ~ 200mM。
9. 一种尼克酸生物转化制备方法，其特征在于，将根据权利要求l所述的产腈水解酶 浑球红细菌或其产腈水解酶的突变抹生长出的菌体生物转化3-氰基吡啶生成所述 尼克酸；或者将经根据权利要求2 ~ 8中任一项所述的腈水解酶诱导方法诱导的浑 球红细菌或其产腈水解酶的突变林生长出的菌体生物转化3-氰基吡啶生成所迷尼 克酸。
10. 根据权利要求9所述的尼克酸生物学制备方法，其特征在于，所述转化的温度为 20~ 37°C。
11. 根据权利要求10所述的尼克酸生物学制备方法，其特征在于，所述转化为摇瓶转 化，所述摇瓶转化的温度为30°C 。
全文摘要
本发明提供了一种产腈水解酶的浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，保藏编号为CCTCC M209065)，可在一般性丰富培养基中进行培养并产酶，采用腈水解酶诱导物进行诱导培养，可提高产酶水平，利用生长出的菌体生物转化3-氰基吡啶可生成尼克酸。腈水解酶诱导物为3-氰基吡啶、3-氰基吡啶结构类似物、短链脂肪腈类化合物、短链脂肪酰胺化合物、芳香类酰胺化合物、芳香羧酸类化合物、短链脂肪羧酸类化合物、尿素或不使用诱导物，腈水解酶诱导物的浓度为1～200mM，本发明的尼克酸生物转化制备方法，生产安全简便，环境友好，副产物少，转化率高。
文档编号C12R1/01GK101575585SQ20091005012
公开日2009年11月11日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者张建国, 张鲁嘉, 杨春生, 涛 王, 王学东, 马成兵, 魏东芝 申请人:华东理工大学;新发药业有限公司