免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物及其快速高产的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物以及获得所述多糖-蛋白质缀合 物的快速高产的缀合方法。更特别地，本发明提供了使用用于产生增强免疫原性的优化多 糖链长度来开发的多糖蛋白质缀合物疫苗。本发明还涉及用于使多糖与载体蛋白质缀合的 具有提高的产率和更高的免疫原性的还原胺化快速方法。
【背景技术】
[0002] 疫苗接种(免疫接种)是引发免疫应答的方式。疫苗接种的方法包括向活的实体施 用疫苗，这继而激活人体的自然免疫系统。疫苗包含小剂量的抗原，其为减弱的病原体或死 病原体(例如细菌或病毒或病原体结构的一部分)的制备物，其在施用后刺激抗体产生或针 对病原体的细胞免疫。
[0003] 在免疫学上，可将抗原分类为T细胞依赖性(TD)抗原或T-细胞非依赖性(TI)抗原。 蛋白质和肽通常是TD抗原并且需要来自辅助T淋巴细胞的刺激以便引发免疫应答，并且由 于记忆B和T淋巴细胞的形成而诱导持久的免疫应答。与此相反，TI抗原刺激B细胞增殖和分 化成分泌抗体的效应细胞，无需T细胞的帮助并且不形成记忆B和T淋巴细胞。大多数这些T 细胞依赖性抗原是刺激产生低亲和力抗体的微生物多糖。
[0004] 在革兰氏阴性菌中，在细菌荚膜中存在的多糖是显示出差的免疫原性的重要毒力 因子。缀合物疫苗是微生物多糖（polysaccharide，PS)抗原与载体蛋白质（carrier protein，CP)偶联的产物，从而将T细胞非依赖性免疫应答转变成T细胞依赖性免疫应答。使 用缀合物疫苗来免疫婴儿和儿童以抵抗包含荚膜多糖的细菌引起的侵入性疾病。抗原性荚 膜多糖与载体蛋白质的偶联产生高度免疫原性的缀合物。
[0005] 碳水化合物-蛋白质缀合物在基础研究中被广泛使用并且作为多种细菌疫苗中的 免疫原。已经付出了巨大的努力来开发用于构建这些缀合物的简单且可靠的方法。虽然通 过还原胺化进行直接偶联是有有吸引力的方法，但其同样具有许多缺点。通过还原胺化的 现有缀合方法是耗时且低产率的方法，同时如此得到的缀合物显示出较低的免疫原性。
[0006] 多糖-蛋白质缀合物的免疫学性能是长度依赖的，可能需要优化多个表位也是一 个公认的事实(Costantino等，1999)。还已知较小多糖片段的选择性末端基团活化方法以 一致的再现性产生了很好地限定了缀合物疫苗。较大尺寸的多糖分子可具有空间上隐藏的 表位，然而较小的片段在缀合后将具有暴露于免疫系统的最大表位。
[0007]已经开发了用于制备较小的多糖片段的数种方法，包括多糖的解聚。在现有技术 中已充分地描述了多糖的解聚。例如，Laferriere等，2011年的文章 "Experimental design to optimize an Haemophilus influenzae typeb conjugate vaccine made with hydrazide-derivatized tetanus toxoid"对其进行了详细的描述一个主要的缺点是该 方法花费很长的时间（32小时以上），并具有约15%的缀合物产率。Anderson等，1986年也描 述了使用较小尺寸的多糖用于与白喉类毒素缀合，并发现由20个重复单元的Hib-PRP制成 的缀合物比由8个重复单元制成的那些具有更强的免疫原性。他们的方法也花费很长的时 间，即超过5天。
[0008]本发明通过提供用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提尚的广率和更尚的免疫 原性的还原胺化的快速方法克服了现有技术的缺点。本发明的方法需要较短的缀合时间。 本发明还提供了通过向免疫系统更好地暴露抗原表位的免疫原性增强的小尺寸多糖。
[0009] 发明目的
[0010] 因此，本发明的主要目的是提供免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物。
[0011] 本发明的另一个目的是提供用于多糖片段化的化学方法。
[0012] 本发明的另一个目的是提供用于流感嗜血杆菌（Haemophilus inf luenzae)b型 (Hib)的免疫原性增强的较低分子量(Lower Molecular Weight，LMff)多糖蛋白质缀合物疫 苗。
[0013] 本发明的另一个目的是提供用于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清 组A和C(MenA和MenC)的免疫原性增强的较高分子量(Higher Molecular Weight，HMW)多糖 蛋白质缀合物疫苗。
[0014] 本发明的另一个目的是提供获得具有较短缀合时间和更高缀合物产率的多糖-蛋 白质缀合物的快速方法。
【发明内容】
[0015] 因此，本发明提供了免疫原性增强的多糖-蛋白缀合物和获得所述多糖-蛋白质缀 合物及其疫苗的快速高产率缀合方法。
[0016] 本发明提供了优化分子量的多糖-蛋白质缀合物，其中多糖被片段化成分子量在 100±40kD的范围内，更优选地具有约100kD的平均分子量。
[0017] 本发明还提供了制备Hib多糖-蛋白质缀合物的优化的低分子量多糖，其中多糖片 段被片段化为分子量在12±6kD的范围内，更优选地具有约10kd的平均分子量。
[0018] 本发明还公开了用于将Hib荚膜多糖（即PRP(聚核糖基-核糖醇-磷酸））化学分解 为12±6kD的尺寸的具有较低多分散性且具有可再现性结果的方法。
[0019] 本发明还公开了用于将天然荚膜多糖(例如但不限于MenA和MenC)化学分解为100 ±40kD的尺寸的方法，其示出了可再现结果的低多分散性。
[0020] 在一个优选的实施方案中，本发明提供了多糖的化学降解，其中将所述多糖样品 与偏高碘酸钠（sodium-metaperiodate)放在一起保持预定的时间并在凝胶过滤柱上直接 脱盐。
[0021] 纯化所述的多糖样品并对纯化的多糖进行分析测定用以评估物理化学性质，包括 PS含量、唾液酸含量、磷含量、蛋白质杂质、核酸杂质、内毒素、同一"性以及水分含量。分析纯 化的多糖的总含量并通过产生醛基进行衍生化。
[0022] 本发明还提供了多糖-蛋白质缀合物，其中可在较小的多糖片段上进行选择性的 末端基团活化。对于Hib多糖和脑膜炎球菌血清组，典型的多糖被氧化剂(例如偏高碘酸盐/ 酯(metaperiodate))分别片段化为约10kD和100kD的较小质量，并使用还原胺化化学将其 与衍生化的载体蛋白质缀合。
[0023] 载体蛋白质是破伤风类毒素、CRM197或其他合适的载体蛋白质，其被激活并分析 蛋白质含量和活化度(degree of activation)。在催化试剂的存在下，使用一水合肼作为 接头将肼基团与载体蛋白质连接。所述催化试剂的非限制性实例是HXX1-乙基-3-(3-二甲 氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）。
[0024] 缀合步骤包括衍生化的多糖与衍生化的载体蛋白质（例如破伤风类毒素）的缀合。 进一步纯化多糖-蛋白质缀合物并分析蛋白质含量与多糖含量之比、游离多糖、尺寸分布和 效力。
[0025] 本发明还进行了对多糖-蛋白质缀合物的物理化学分析的分析。在实验的每个阶 段，即，对于初始多糖样品、活化的糖、载体蛋白质、批量缀合物(bulk con jugate)和最终的 疫苗进行该分析。
[0026] 对于Hib，用所产生的缀合物对大鼠进行免疫，对于MenA/MenC对小鼠进行免疫，并 且对血清抗体进行滴定以评估免疫潜力。对于Hib和MenA/MenC，通过间接的IgG-ELISA确定 抗体效价(titer )，并且MenA和MenC缀合物的血清杀菌测定等于或高于用参考疫苗获得的 那些。因此该方法成本效益好且耗时较少。
[0027] 本发明最重要的成果是使用优化分子量的各多糖在远远更短的时间和更好的缀 合产率下使所产生的缀合物获得更好的免疫原性。
[0028] 附图简述
[0029]图1描绘了还原胺化方法的示意图。
[0030]图2描绘了使用如通过RI检测器所监测到的在TSK 4000-5000PWXL柱上获得的解 聚且活化的Hib PRP的高效液相色谱系统(SEC-HPLC)图谱的尺寸排阻色谱。
[0031] 图3a和3b描绘了如通过RI检测器所监测到的在TSK 4000-5000PWXL柱上活化的 MenA和MenC多糖的SEC-HPLC洗脱图谱。
[0032] 图4描绘了通过UV检测器所监测到的在TSK 4000-5000PWXL柱上Hib PRP-TT缀合 物在SEC-HPLC图谱中的位移。
[0033]图5描绘了PRP-TT缀合物的SDS-PAGE分析。样品泳道含有以下：泳道1 -蛋白质分子 量标准，泳道2-低分子量的PRP-TT缀合物，泳道3-高分子量的PRP-TT缀合物，以及泳道4-天 然TT。
[0034] 图6描绘了通过UV检测器监测到的TSK 4000-5000PWXL柱上MenA-TT缀合物和 MenC-TT缀合物的SEC-HPLC图谱的位移，与游离的破伤风类毒素进行了比较。
[0035]图7描绘了在抑制ELISA中，MenC-TT缀合物的抗体抑制百分比的图示。
[0036]图8描绘了在第0、28和42天3次给药后，通过ELISA测定大鼠中的Hib缀合物免疫原 性来确定血清IgG效价。在第0、28、42、49和70天以不同的剂量水平以及用不同尺寸的!1化 PS来评估抗体效价。
[0037] 图9描绘了通过ELISA测定小鼠中的脑膜炎球菌血清组A缀合物免疫原性来确定血 清抗MenA IgG效价。
[0038] 图10描绘了通过ELISA测定小鼠中的脑膜炎球菌血清组C缀合物免疫原性来确定 血清抗MenC IgG效价。
[0039] 图11描绘了通过血清杀菌测定小鼠中的脑膜炎球菌血清组C缀合物的免疫原性来 确定抗MenC血清功能性抗体效价。
[0040] 具有举例说明和实施例的发明详述
[0041] 大多数蛋白含有来自C末端官能团和天冬氨酸以及谷氨酸侧链的大量羧酸基团。 这些基团易于被亲核化合物修饰以产生稳定的酰亚胺产物。而亲核官能团易于与醛基反 应，但其不会自发地与羧酸盐/酯或羧酸基团反应。首先必须用其他化合物活化羧酸基团以 使其对亲核试剂发生反应。在本发明中，在水溶液中用水溶性交联剂处理所述蛋白质以使 羧基与胺缀合。所述交联剂的一个非限制性实例是碳二亚胺H