水貂绿脓杆菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水貂绿脓杆菌疫苗，尤其涉及一种水貂 绿脓杆菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种条件性致病菌， 对外界环境适应能力很强，在潮湿环境下可以长期存活。绿脓杆菌能引起水貂发生急性传 染病，以出血性肺炎和败血症为主要特征，发病急，死亡快，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红 色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。常呈地 方性暴发流行，发病貂场死亡率在10%~50%，给养貂业造成了较大的经济损失。
[0003] 目前，对绿脓杆菌感染的治疗有抗菌素和免疫两种治疗方法。常用药物替米考星、 阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，这是由于长期使用抗菌素治疗水貂绿脓杆菌导致大 量耐药菌株的产生，并破坏了动物机体中正常菌群，引起继发感染，从而导致治疗失败。目 前已检测出11型绿脓杆菌，因此单一价态的水貂绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求。 传统的全菌苗和亚单位疫苗均为细菌的某一成分的整体结构，如外毒素或鞭毛蛋白；副作 用明显，如产生过敏反应，对水貂会造成严重的病理性损伤；而且制备方法烦琐，费时、费 力、产量极低，纯度更低。
[0004] 发明专利申请201210095852. 4公开了 "一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备 工艺"。该申请公开了一种由两种绿脓杆菌菌株制备的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。将所 述绿脓杆菌菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1:1比例混合，加蜂胶制 备水貂蜂胶绿脓杆菌二价灭活疫苗。该发明所述的绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗为全菌苗，因此 极有可能产生副作用。如产生过敏反应，对水貂会造成严重的病理性损伤；而且制备方法烦 琐，费时、费力、产量极低，纯度更低。
【发明内容】
[0005] 针对目前水貂绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫需求的现状，本发明提供了一种水 紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗并对其免疫效果进行评价。
[0006] 本发明的技术方案是：exoA_fIiC嵌合蛋白，序列为由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 和序列为SEQ ID NO: 1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的编码基因为水貂绿脓杆 菌exoA的I+II区与fliC的N端510bp ;所述嵌合蛋白能够引起针对水紹绿脓杆菌的保护 性免疫。
[0007] 优选的是，所述exoA-fliC嵌合蛋白经糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。
[0008] 水紹绿脓杆菌亚单位疫苗，包含药学有效量的exoA-fliC嵌合蛋白，所述疫苗能 够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌 合蛋白的浓度为0. 350~0. 766mg/ml。
[0009] 所述疫苗中还含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml。所述蜂 胶干物质购买自滨州华宏生物制品有限责任公司。
[0010] 水紹绿脓杆菌exoA-f IiC嵌合蛋白经Western blot检测，发现重组蛋白具有与水 貂绿脓杆菌全菌制的抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性。
[0011] 术语"药学上可接受的媒介物"意指任何合适的常用于药物制剂的可接受的赋形 剂、佐剂、载体、稀释剂。
[0012] 水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，通过下述方法制备：向嵌合蛋白上清中加入蜂胶溶液， 使蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml ;充分搅拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋 白亚单位疫苗。所述重组蛋白上清中蛋白浓度为0. 350~0. 766mg/ml。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] (1)本发明得到的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗经皮下接种6-8周龄 的BALB/c小鼠，免疫4次后，于免疫后72天至9周取血测抗体，诱导产生了较高水平的 exoA-fliC特异性IgG抗体，其IgGl/IgG2a比值亦显著升高，明显倾向于Th2型免疫应答。 经皮下接种4-6月龄的健康貂，接种21d后取血测绿脓杆菌抗体，免疫组绿脓杆菌抗体全 部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。本结果显示制备的水貂绿脓杆菌 exoA-fliC基因工程亚单位疫苗可以引起水貂的免疫应答。
[0015] (2)本发明使用基因工程的方法制备水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不 但安全性大大提高，而且制备过程省时、省力、产量高。
【附图说明】
[0016] 图1是实施例1中exoA-fliC融合基因扩增结果；
[0017] 图2是实施例1中exoA-f IiC嵌合蛋白SDS-PAGE可溶性分析；
[0018] 图3是实施例1SDS-PAGE法分析exoA-fliC嵌合蛋白的纯度；
[0019] 图4是实施例2中exoA-fliC嵌合蛋白的western blot分析；
[0020] 图5是实施例5重组exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠血清中特异性抗体 水平。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0022] 实施例1 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白的表达及纯化
[0023] 1、细菌基因组DNA的提取
[0024] 水貂绿脓杆菌山东分离株PASD01 (经PCR方法分型鉴定为鞭毛抗原基因 A型）过 夜培养5ml备用，取Iml菌液至灭菌I. 5ml的离心管中，8000r/min离心5分钟，弃去上清， 用IOOul的双蒸水重悬。沸水煮15分钟，放在-20°C或-80°C冰柜反复冻融3次。5000r/ min离心5分钟，收集上清，即为所提DNA。-20°C保存备用。
[0025] 2、引物设计和exoA基因、fliC基因的克隆、测序
[0026] (1)引物设计
[0027] 应用Primer 5. 0设计exoA(I区+11区）基因的上下游引物，根据铜绿假单胞菌 鞭毛蛋白8821型设计fliC基因的引物。在exoA基因的上游引物引入Bam HI酶切位点， 在fliC基因的下游引入Xho I酶切位点。引物序列分别是：
[0028] exoA 上游引物：5 ' -GGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3 '
[0029] exoA 下游引物：5 ' -GTGTTGACGGTCAAGGCCATGCCGTCGCCGAGGAACTC-3 '
[0030] fliC 上游引物：5' -GAGTTCCTCGGCGACGGCATGGCCTTGACCGTCAACACCAAC-3'
[0031] fliC 下游引物：5' -CTCGAGTGTTCAGCGACTCTGCGCTCATCTC-3?
[0032] 下划线分别是Bam HI、Xho I酶切位点；
[0033] (2) exoA基因和fliC基因的扩增
[0034] 首先，以上述提取的细菌基因总DNA为模板，进行PCR扩增。
[0035] 扩增 exoA基因与 fliC基因的反应体系为：10XPfu Buffer with MgS042+2.5 yL， d NTP 2 μ L，上游引物 0.5 μ L，下游引物 0.5 μ L，模板 I μ L，Pfu DNA Polymerase 0.5 μ L， 灭菌去离子水14. 0 μ L，40%的甘油3 μ L，DMS01 μ L。
[0036] 扩增exoA基因的PCR反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性lmin，68. 2°C退火 1111；[11，72。(^延伸3111；[11，30。5^168,72。(^延伸20111；[11。
[0037] 扩增fliC基因的PCR反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性lmin，57. 9°C退火 lmin，72°C延伸2. 5min，30cycles，72°C延伸20min。反应完毕后取5 μ L的反应产物，1 %的 琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
[0038] (3) PCR产物回收
[0039] 灌制可上样100 y L的1. 0%琼脂糖凝胶，将PCR产物分别加入电泳上样孔中，指示 剂迀移至适当位置时停止电泳，在365nm紫外光下切下含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP 管中，称取重量后，参照OMEGA公司的普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒说明书进行。
[0040] (4) exoA基因、fliC基因与T载体的连接
[0041] 将上述ex〇A，fliC基因片段胶回收产物进行加 A (Pfu高保真酶不可以自动加 A， 没法连普通的T载体），反应体系为：Taq酶0.5 μ L，10 X Buffer 1 μ L，d ΝΤΡ0. 5 μ L，胶回 收产物8 μ L。反应程序：72°C 20min。
[0042] 将加 A后的产物分别连到pMD19-T Vector上，连接体系为：pMD19-T Vector luL，目的基因片段4yL，Solution I 5yL，4°C连接过夜。将连接产物导入到DH5a感 受态细胞中，涂布于含有〇. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板，37°C培养过夜；挑取单菌 落经菌液PCR及质粒酶切鉴定正确后测序，即得到插入序列正确的重组克隆载体，命名为 pMD19-T-exoA，pMD19-T-fliC。
[0043] 3、构建重组克隆载体 pMD19-T-exoA-f IiC
[0044]