6] 将50只水紹，随机分成10组，每组5只。第1、5组分别皮下注射0.1 ml水貂绿脓 杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗；第2、6组分别皮下注射0. 25ml亚单位疫苗；第3、7 组分别皮下注射0. 5ml亚单位疫苗；第4、8组分别皮下注射Iml亚单位疫苗；第9、10不做 免疫。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0077] 免疫21d后，第1、2、3、4组分别皮下注射SDOl菌株；第5、6、7、8组分别皮下注射 SD03菌株；观察记录小鼠死亡情况。结果见表2所示。
[0078] 结果显示，水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗不同剂量免疫水紹21d 后，用含有2XLD5(ISD01、SD03菌株分别攻毒，lml、0. 5ml免疫组均达到100%保护；0. 25ml 免疫组对SDOl菌株达到100 %保护，对SD03达到80%的保护；0.1 ml免疫组对SDOl、SD03 菌株保护率为80 %、60 %;对照组全部死亡。根据实验结果，确定水貂绿脓杆菌菌exoA-f IiC 嵌合蛋白亚单位疫苗对水貂的最小免疫剂量为〇. 25ml。
[0079] 分别采用201501批次和201502批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚 单位疫苗进行最小免疫剂量测定的相关实验，结果与采用201503批次的水貂绿脓杆菌 exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗一致。
[0080] 表2水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对水紹的MID测定结果
[0081]
[0082] 实施例5 :水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗免疫效果评价
[0083] 1.实验动物免疫
[0084] 将30只BALB/c健康小鼠，随机分为3组，每组10只。第1组皮下注射201503批 次的水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗0. 2ml。第2组皮下注射0. 2ml的蜂胶 佐剂，第3组皮下注射0. 2ml PBS作为空白对照组。
[0085] 2. ELISA 检测
[0086] (1)免疫后9周将各组小鼠摘除眼球并收集血清，_20°C保存备检。
[0087] (2)将exoA-fliC嵌合蛋白稀释至5 μ g/ml，100 μ 1/孔进行常规包被96孔板。
[0088] (3)各组小鼠血清样本用过滤后的无菌PBS按1:200倍比稀释，200 μ 1/孔加至每 列第一孔，每列第2至8孔分别加入100 μ I PBS，每个样本做复孔，然后从第一孔取100 μ 1 加到第2孔中依次进行倍比稀释至1:25600,空白对照孔加入包被缓冲液100 μ 1。
[0089] ⑷HRP标记兔抗鼠二抗的稀释度分别为：IgG 1:5000, IgGll: 10000， IgG2a:1:10000 ；
[0090] (5)结果处理：将每一个样本OD值减去空白对照孔OD值后，同一血清样品复孔取 平均OD值。其中以PBS阴性对照组的OD值为阴性对照（N)，免疫组为样本（P)，当血清P/ N值3 2. 1即可判断为阳性。抗体滴度以出现阳性结果的最高稀释倍数的倒数表示。
[0091] (6)结果计算于：各样品结果表示为Iogltl(抗体滴度），每个样品复孔间取平均值 即为该小鼠的实际值，同一小组内计算平均值和标准误，进行统计分析。IgGl :IgG2a以每 只小鼠的抗体滴度相比，同一组内结果以平均值土标准误表示并进行统计学分析。
[0092] 将15只健康水貂随机分为3组，每组5只。第1组皮下注射201503批次的水貂 绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗lml，第2组皮下注射Iml的蜂胶佐剂，第3组皮 下注射ImlPBS作为空白对照组。方法同小鼠抗体的测定。结果显示exoA-fliC嵌合蛋白 组水貂体内产生最高水平的特异性IgG抗体。实验结果见表3和图5。
[0093] 由实验结果可见：佐剂对照组中无明显的特异性IgG抗体及其亚类产生； exoA-fl iC嵌合蛋白组小鼠体内产生最高水平的不同类型抗体滴度，即IgG (1:12800)， IgG2a(l:1600)和 IgGl(l:6400)。exoA-fliC 组 IgGl/IgG2a 比值最高（4. 13±0.67)。
[0094] 表3小鼠体内IgG、IgGl、IgG2a抗体水平的测定结果
[0095]
[0096] 3.免疫攻毒保护试验
[0097] 表4水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对小鼠免疫保护试验定结果
[0098]
[0099] 将60只BALB/c健康小鼠，随机分为6组，每组10只。第1、2组分别皮下注射0. 2ml 水貂绿脓杆菌exoA-fliC基因工程亚单位疫苗，第3、4组分别皮下注射0. 2ml的蜂胶佐剂， 第5、6组皮下注射0. 2mlPBS作为空白对照组。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓 杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0100] 免疫后21d，第1、3、5组分别进行皮下注射2XLD5(ISD01菌株，第2、4、6组分别进 行皮下注射2XLD 5(ISD03菌株观察记录死亡情况。结果见表4。
[0101] 由表4可知，水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗免疫小鼠21d后，用 2 X LD5tlSDOl、SD03菌株分别攻毒，均可获得100%的保护率，佐剂组获得20 %、10%的保护 率，对照组全部死亡；结果表明水貂绿脓杆菌exoA-f IiC嵌合蛋白疫苗对小鼠对SDOI、SD03 有良好的免疫保护效果。
[0102] 表5水紹绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗对水紹免疫保护试验定结果
[0103]
[0104] 将30只水貂，随机分为6组，每组5只。第1、2组分别皮下注射Iml水貂绿脓杆 菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗，第3、4组分别皮下注射Iml的蜂胶佐剂，第5、6组皮下 注射ImlPBS作为空白对照组。所述亚单位疫苗为201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC 嵌合蛋白亚单位疫苗。
[0105] 免疫后21d，第1、3、5组分别进行皮下注射SDOl菌株，第2、4、6组分别进行皮下注 射SD03菌株，观察记录死亡情况。结果见表5。
[0106] 由表5结果显示，攻毒的PBS空白对照组、蜂胶佐剂全部死亡，嵌合蛋白亚单位疫 苗对SDOl菌株攻毒水貂的保护率为100%，对鞭毛蛋白为b型的SD03菌株攻毒水貂的保护 率为100%，表明该嵌合蛋白亚单位疫苗对鞭毛蛋白为a、b型的菌株都有较强的免疫保护 作用。
[0107] 分别采用201501批次和201502批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位 疫苗进行免疫效果评价的相关实验，结果与采用201503批次的水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌 合蛋白亚单位疫苗一致。
【主权项】
1. 嵌合蛋白exoA-fliC，其特征在于：序列为由SEQIDNO: 2的氨基酸序列和序列为 SEQIDN0:1的核苷酸序列；所述嵌合蛋白exoA-fliC的编码基因为水貂绿脓杆菌exoA的 I+II区与fliC的N端510bp;所述嵌合蛋白能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫。2. 根据权利要求1所述的嵌合蛋白exoA-fliC，其特征在于：所述嵌合蛋白exoA-fliC 经糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。3. 水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：包含药学有效量的权利要求1或2所述的 嵌合蛋白exoA-fliC，所述疫苗能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上 可接受的媒介物。4. 根据权利要求3所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中嵌合蛋 白的浓度为〇. 350~0. 766mg/mL。5. 根据权利要求3或4所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中还 含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10~15mg/ml。6. 根据权利要求3或4所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包 括以下步骤：向exoA-fliC嵌合蛋白上清中加入蜂胶溶液，使蜂胶干物质的含量为10~ 15mg/mL;充分搅拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋白亚单位疫苗。7. 根据权利要求6所述的水貂绿脓杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述 exoA-fliC嵌合蛋白上清中蛋白浓度为0. 350~0. 766mg/mL。
【专利摘要】本发明提供了一种水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白亚单位疫苗，包含药学有效量的exoA-fliC嵌合蛋白。exoA-fliC嵌合蛋白的序列为由SEQ ID NO:2的氨基酸序列和序列为SEQ ID NO:1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的编码基因为水貂绿脓杆菌exoA的I+II区与fliC的N端510bp。所述疫苗能够引起针对水貂绿脓杆菌的保护性免疫，并且包含药学上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌合蛋白的浓度为0.350～0.766mg/ml。所述疫苗中还含有蜂胶干物质，所述蜂胶干物质的含量为10～15mg/ml。本发明使用基因工程的方法制备水貂绿脓杆菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不但安全性大大提高，而且制备过程省时、省力、产量高。
【IPC分类】C07K19/00, C07K14/21, A61K39/104, A61P31/04
【公开号】CN104892768
【申请号】CN201510240573
【发明人】秦晓冰, 单虎, 马凤芹
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日