由杂交瘤细胞系分泌的抗Ki67单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂 交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞核内Ki67分子的单克隆抗体，对该 抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用 于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC)、酶联免疫吸附（ELISA)或免疫印迹 (Western Blot)方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法 中，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002] Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中 是不可缺少，但其确切机制尚不清楚，Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，阳性说明癌细胞 增殖活跃。
[0003] 作为一种存在于增殖细胞中的核抗原，Ki67的确切功能目前尚不清楚，但通过研 宄它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此 是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研宄表明Ki67免疫的反应与细胞周期 密切相关，在Gl、S、G2、M期均表达，但GO期无表达，而且还发现Ki67在Gl晚期/S早期微 量表达，S期聚集，尤其在后半期表达率明显增高，有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定 簇，故认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。目前有研宄表明在多种实体 恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展，转移及预后有关。国外有 报道Ki67在乳腺癌组织中阳性率为78. 0%。有报道Ki67的表达与乳腺癌肿瘤的生长和 浸润以及淋巴结转移之间存在着密切相关性，即Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性 程度大，细胞增殖活跃，因此肿瘤生长速度快，侵袭性大，转移的机会高，预后差。但其机制 目前尚不清楚。关于乳腺癌组织中Ki67表达对于乳腺癌的预后判断以及指导治疗价值有 待进一步研宄，但近来有文献报道Ki67可作为乳腺癌化疗敏感性指标，肿瘤细胞增殖率降 低，比肿瘤的肿块缩小更能反映肿瘤对化疗敏感程度，而且还有研宄表明Ki67的表达比T 分期能更好预测肿瘤的放射敏感性。应用免疫组化技术检测乳腺癌组织中多项生物指标简 单、易行，为乳腺癌患者的临床评估提供参考，并有助于临床个体化治疗。Ki67与PCNA这类 增殖标记及c-erbB-2、p53等一同被列为仅次于激素受体、组织学级别的乳腺癌第二类预 后指标，由于Ki67在GO期以外各增殖周期均有表达，更具可用性。两者具有一定的互补 性。Ki-67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高，表明Ki67 染色阳性程度与组织学分级的相关性。表明Ki67表达与乳腺癌发生、发展有关，是一个不 良预后因素，对乳腺癌的诊断治疗及预后评价有重要的参考价值。与Ki67不同的是，PCNA 的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记， 检测PCNA可以评价肿瘤细胞增殖状态，也有研宄显示PCNA与某些肿瘤的预后及诊断有一 定关系。在乳腺癌的预后研宄中，PCNA在肿瘤的良恶性的区分、恶性程度的确定及评估预 后等方面有较广泛的应用。
[0004] Ki67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研宄中的热门生物指标，可以通过对 抗原的检测，了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。公开号为CN 101896819 A的发明专利"对癌 症的诊断测试、预测测试和预后测试"的发明专利描述了一种利用孪蛋白、Aurora A、Plkl、 Ki67和H3S10ph几种蛋白标志物，采用点印迹分析、狭线印迹分析、RIA、肽微阵列和ELISA 方法进行肿瘤预后评估的方法。申请号为CN201110088864的发明专利"蛋白组合物及其在 制备肺癌诊断试剂盒中的应用"则公开了一种利用p53、p63、Ki67、MCM7及EGFR五种蛋白 的组合物配体，如单克隆抗体对肺癌进行诊断的方法。
[0005] 目前在肿瘤诊断中使用最多的Ki67抗体为克隆号MIBl的单克隆抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供由杂交瘤细胞系分泌抗Ki67单克隆抗体及其应用。提供 一种设计和制备Ki67抗原肽的方法，该抗原由Ki67分子中具有特征性序列的多肽经化学 合成后与载体蛋白偶联制备而来。本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的 Ki67单克隆抗体的制备方法，该抗体能特异结合Ki67重组抗原和天然抗原。本发明的第三 个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。
[0007] 所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8,已于2015年2月5日在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一 号院3号，保藏号为CGMCC No. 10402。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明对在乳腺癌和其他恶性肿瘤中细胞核表达的Ki67分子，按照公布的序列进行 分析，依据其内在重复序列的氨基酸组成、抗原性以及序列的亲疏水性、二级结构以及序列 的特异性等特征选择适宜合成又具有良好免疫原性的第1213-1232位肽段用于化学合成， 为提高其免疫原性，在N端增加一个Cys用于和载体蛋白偶联作为免疫原，免疫Balb/c小 鼠。经细胞融合、重组Ki67筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0009] 利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获 得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgGl亚型的单克隆抗体，亲和 常数为7. 68 X 109。免疫印记（Western blotting)实验显示该抗体能特异识别重组的Ki67 蛋白。
[0010] 具体地，本发明涉及以下几个方面： 一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。
[0011] 所述抗体特异识别由SEQ ID No. 1所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0012] 所述的单克隆抗体，其免疫原为按照SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经化学合成 多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白（（keyhole limpet hemocyanin， KLH)的自由疏基偶联而成的蛋白质。
[0013] 单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系73043-24E8,已于2015 年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10402。
[0014] 其分泌抗体的重链和轻链可变区序列，重链可变区由SEQ ID No. 4所示的DNA序 列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 5,轻链可变区由SEQ ID No. 6所示的 DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 7。
[0015] 所述的单克隆抗体，其可识别重组蛋白和肿瘤细胞的Ki67分子。
[0016] 单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及 正常组织细胞Ki67蛋白的表达情况。可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、月中 瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法。
[0017] 所述的单克隆抗体，在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。
[0018] 本发明的优点及有益效果 (1)本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8)分泌产生的单克隆抗体，能识别重 组蛋白Ki67和表达Ki67的淋巴细胞，能够检测高表达Ki67蛋白的乳腺癌等多种肿瘤组 织。
[0019] (2)本发明获得的小鼠杂交瘤细胞系（73043-24E8)所分泌的单克隆抗体为一种 IgGl类抗体，与Ki67蛋白的结合有极强特异性和敏感性。
[0020] (3 )本发明获得的杂交瘤细胞系（73043-24E8 )所分泌的的单克隆抗体可应用于免 疫组织化学（IHC)、免疫印记（Western blotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛 查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化抗体MIBl的对比实验中，本发明细胞 株制备的抗体在乳腺癌的诊断中特异性同对照抗体相当，敏感度优于已有的抗体。因此，本 发明的Ki67单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。
【附图说明】
[0021] 图I :73043-24E8抗体的识别特性和实际应用效果 应用纯化的73043-24E8单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出Ki67重组蛋 白，重组GST-Ki67片段融合的重组蛋白上样10微升，HRP酶标羊抗鼠按照1:5000稀释，目 标蛋白为38kDa左右。
[0022] 图2 :Ki67单克隆抗体73043-24E8的免疫组织化学检测结果 应用纯化的Ki67抗体同商品化抗体MIB-I在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为 对照抗体MIB1，右为纯化抗体73043-24E8。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合图表和【具体实施方式】对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以 更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
[0024] 实施例1多肽合成和重组抗原制备 一、抗原多肽选择 依据Uniprot及Genbank中登录号为P46013和GI: 118572663的蛋白质序列进行序列 和二级结构分析，全长为3256个氨基酸长度的Ki67蛋白由N端的FHA结构域（Forkhead associated domain，FHA)以及多个长度为11