公司）。将膜置于含 5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4°C过夜。加入单克隆抗体73043-24E8 (I :1000稀释）4°C 孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入I :5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限 公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限 公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
[0036] 实施例5抗体的可变区序列测定 取培养新鲜的杂交瘤细胞系，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株 的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集IO6以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交 瘤细胞总 RNA，取 9 yL 总 RNA，加入 2.5 yLoligo(dT)12-18primer (10mM)，及 5 yL dNTPs，混合均匀，70°C保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。 随后加入 5 yL RT buffer (5X)，2.5 yL DTT (0.1 M)及 I yL 逆转录酶，42°C 反应 1 小时。70°C孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20°C。将获得的第一链cDNA进 行PCR扩增，在50 yL反应体系中加入引物各25 pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引 物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序 列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV. Bl直至MHV.B12的11条引物 为上游引物，可分别与重链下游引物MHC. F组合用于扩增重链可变区基因。
[0037] MHV. B1:5 ' -GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3， MHV. B2:5 ' -CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3， MHV. B3:5 ' -CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3， MHV. B4:5 ' -AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3 ' MHV. B5:5 ' -GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3 ' MHV. B6:5 ' -GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3， MHV. B7:5 ' -CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3 ' MHV.B8: 5' -GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3， MHV.B9: 5' -GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3， MHV. BIO: 5' -GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3' MHV. B12: 5' -GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3， MHC. F:5' -GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3' 用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV. BI直至MKV. BlO的IO条引物为上游引物， 可分别与轻链下游引物MKC. F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。
[0038] MKV.B1: 5， -GATGTTTTGATGACCCAAACT -3， MKV.B2: 5' -GATATTGTGATGACGCAGGCT-3' MKV.B3: 5' -GATATTGTGATAACCCAG-3' MKV. B4: 5' -GACATTGTGCTGACCCAATCT-3' MKV.B5: 5' -GACATTGTGATGACCCAGTCT-3' MKV. B6: 5' -GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3' MKV. B7: 5' -GATATCCAGATGACACAGACT-3' MKV.B8: 5' -GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3' MKV. B9: 5' -CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3' MKV.B10: 5' -GACATTCTGATGACCCAGTCT-3' MKC. F: 5' -GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3' 其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1 μ L和IU热启动Taq DNA 聚合酶。设置PCR扩增程序为94°C 40秒，52 °C 40秒，72 °C 40秒，进行20至25个循环，最后 72 °C延伸3分钟，产物可置于4°C备用或直接电泳。取20 μ L PCR产物进行电泳分析，在1. 5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之 间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。
[0039] 实施例6.组织芯片染色和鉴定 一.芯片制备过程 对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空 白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在66~68 °C )倒入模具，冷却至 室温后将模具放入-20 °C冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1.5mm 直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3~4 _，用另一直径I. 5mm的打孔针在蜡块的标记 部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1 mm左右。将采集到的组织芯直接插 入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后 用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡 块制作模具，放入70 °C烤箱内IOmin，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤 箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 °C冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 °C冰箱内保存备用。修片后进行连续 切片，厚度定为4 μ m，将连续切片漂在凉水中，让其自然展开，再将分开的切片转移到45 °C的温水中展片30秒，用经2 % APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片 放入70 °C烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4°C冰箱保存。
[0040] 二· IHC染色及分析 常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟， 最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3 X 3分钟。滴加3%H202 孵育10分钟，PBS冲洗3X 3分钟。甩去PBS，滴加封闭液(动物非免疫血清）室温孵育10 分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比 例）室温（25°C )孵育1小时，PBS冲洗3 X 3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗 3 X 3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返 蓝30秒。按照85% (3分钟）-95% (3分钟）-100% (3分钟）-100% (3分钟）的酒精梯度依 次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。
[0041] 三.数据统计 根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率(着色样本数/样本总数)，见表 Io
[0042] 表1 Ki67同Ki67 (MIB-I)在肿瘤组织中的表达差异比较
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞系分泌。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体特异识别由SEQIDNo. 1 所示的DNA编码的Ki67蛋白，该蛋白具有SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列。3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其免疫原为按照SEQIDNo. 3 所示的氨基酸序列经化学合成多肽后，通过其N末端的半胱氨酸与钥孔虫戚血蓝素蛋白 ((keyholelimpethemocyanin，KLH)的自由疏基偶联而成的蛋白质。4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述的杂交瘤细胞系为小鼠杂交 瘤细胞系73043-24E8,已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo. 10402。5. 根据权利要求1所述的的单克隆抗体，其特征在于：其分泌抗体的重链和轻链可变 区序列，重链可变区由SEQIDNo. 4所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸序列为 SEQIDNo. 5,轻链可变区由SEQIDNo. 6所示的DNA序列编码，对应的重链可变区氨基酸 序列为SEQIDNo. 7。6. -种如权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征在于：独立或与其他抗体组合 应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法上。7. -种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种可以识别人Ki67蛋白质分子的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系，本发明选择一段Ki67蛋白质特征性的多肽抗原免疫小鼠后筛选获得了制得了一种保藏编号为10402的杂交瘤细胞系73043-24E8，该细胞可分泌针对Ki67分子的单克隆抗体，并可特异性识别Ki67蛋白及肿瘤组织，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中Ki67的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。CGMCC No.1040220150205
【IPC分类】G01N33/68, C07K16/18, C12N5/20, G01N33/577, C12R1/91
【公开号】CN104892759
【申请号】CN201510339210
【发明人】杨清海, 陈惠玲, 周洪辉, 王小亚
【申请人】福州迈新生物技术开发有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日