0个氨基酸左右的重复序列构成，其分子量约 为 359kDa 左右，依据通过在线服务器 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetSurfP/ 预测 的蛋白的二级结构（secondary structure)和表面可及性（Surface Accessibility)参数， 并通过对其抗原性指数（Jameson BA, Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988,4 (I):181-6.)的 分析结果，选择此重复序列靠近C末端的氨基酸序列TPKEKAQALEDLAGFKELFQ作为抗原进行 化学合成(南京金斯瑞生物科技有限公司），为便于偶联，在该多肽的氨基端添加了一个半 胱氨酸用于提供巯基偶联。
[0025] 二、多肽的偶联及纯化 选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按 照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂（Thermo Scientific， 货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100 μ L Ellman试剂储备液，再加 入10 μ L多肽溶液，用Nano Drop分光光度计在λ =412 nm下测其紫外吸收值，如果OD值 >0. 15做下一步；OD值〈0. 15并>0. 05补加多肽，直至达到要求；OD值〈0. 05返回多肽合成 步骤重新质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200 μ L去离子水，配制成10mg/mL 的KLH溶液，在500 μ L的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500 μ L多肽溶液 加入到200 yL的载体蛋白溶液中，将ImL去离子水加入到一个包装的EDC (IOmg)中，缓慢 振摇至完全溶解，取50 μ L加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未 偶联的交联剂和盐类。
[0026] 三.重组Ki67蛋白片段的表达和纯化 为便于对获得的抗体进行筛选和评价，选择Ki67蛋白中第1063至1157位氨基酸区 域，长度为95个氨基酸的片段与GST蛋白融合表达，此段氨基酸的编码序列由南京金斯瑞 生物科技有限公司直接合成并克隆进克隆载体质粒PUC57。该DNA片段5'端和3'端分别带 有feoRI和ZAoI酶切位点，取5 μ L(约1微克)带有Ki67片段的质粒pUC57-Ki67和用作载 体的pET30 (Merck)5yL (约1微克)分别进行双酶切，酶切体系为(TakaRa)lyL， ZAoI(TaKaRa)I μ L，5 μ L IOXbuffer Η，38 μ L ddH20,37°C酶切三小时。酶切产物经 1%琼 脂糖电泳，柱离心式DNA回收试剂盒(北京华大蛋白质研发中心有限公司）切胶回收基因和 载体片段。取2yL回收的线性化载体，3yL酶切回收的Ki67基因片段，5yL 2XEZ-lig T4DNA快连试剂(北京华大蛋白质研发中心有限公司），混匀，室温连接三十分钟。取出-80°C 保存的感受态细胞（BL21)，解冻后加入连接产物，冰上放置30 min。42°C热激90秒后冰浴 2 min后，加入800 μ L无抗性的LB培养基。37°C复苏培养20 min，涂板。从转化的平板挑 单克隆到1.5 ml LB液体培养基中，37°C，200 rpm培养，DNA测序(北京华大基因）。将测序 正确的克隆菌液进行活化，取50yL活化的菌液到5 ml LB液体培养基中，37°C，200 rpm，培 养。将培养的菌液转接到500 ml LB液体培养基混合，37°C，200 rpm，培养至0D=0. 6-0. 8， IPTG (0.5 mM)低温过夜诱导。400 ml大离心筒，6000 rpm，离心5 min收集菌体，弃上清。 沉淀用20-30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和终浓度为0.5 M的NaCl溶液吹散，超声破 碎菌体。12000rpm离心20分钟，取离心上清上样到Ni-NTA镍柱（QIAGEN)进行纯化，之后 分别用含15 mM咪唑、60 mM咪唑、300 mM咪唑的10 mM Tris-HCl (pH 8.0)(含0.5 M氯 化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用。
[0027] 实施例2杂交瘤细胞系的建立 一、免疫 将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌 性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点， 剂量为6(^g/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司，F5506)乳 化，剂量为3(^g/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA (波长450nm)检测小鼠血清中 抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量 为5〇Pg/只。
[0028] 二、细胞融合 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 (ATCC NumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37°C水浴中， 在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(R〇che公司），并搅动细胞。在温水中静置Imin后，加 入IOml无血清的IMDM (Sigma公司），混勾，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入IOml血 清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司）的胸腺细胞， 混匀。再加入25ml含有2. 1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均 匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37°C 5%C02培养箱中培 养。
[0029] 三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先 准备好培养基的96孔培养板中，放入37 °C 5% 0)2培养箱中培养。
[0030] 3天后，细胞量大约占底面积2/3,取10〇μL上清用免疫原和合成多肽分别进行 ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入20〇μL含饲养细胞和1%HT (Sigma公司）的完全培养 基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的 24孔板培养。五天后取10〇μ1上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细 胞培养瓶扩大培养并冻存。
[0031] 实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体 一、腹水制备 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数~5Χ 105, lml。悬浮的细胞腹腔 注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4°C离心4000 rpm， lOmin。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4°C或-20°C保存。
[0032] 二、单克隆抗体的纯化 用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE 胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20°C。
[0033] 实施例4单克隆抗体特性鉴定 一、亚类鉴定 用IOOmM PBS (pH7. 4)稀释包被羊抗鼠 IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 Kg/ml，每孔加10〇μ1，4?，过夜。倾空液体，用含0. 05% Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔 加入20〇μ1封闭液(含2%BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。 每孔加入0.1 ml杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液I :1000 稀释HRP标记的羊抗鼠（κ，λ )抗体或I :2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgGl，IgG2a， IgG2b，IgG3, IgA)抗体（Southern Biotech公司）0· Iml每孔分别加入适当的孔中，37°C孵 育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加5〇μL含0· 15% ABTS (Southern Biotech公 司）和0. 03% H2O2的柠檬酸缓冲液（PH4. 0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下 的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgGl型鼠源单克隆抗体。
[0034] 二、亲和常数测定 包被重组Ki67蛋白，包被浓度为2Pg/ml，10〇μL7孔，4°C包被过夜，PBS-T洗3次。每 孔加20〇μ1封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从I :200 开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠 二抗I :20000稀释，每孔10〇μL，37?孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入10〇μ1含0. 1% TMB (Sigma公司）和0. 03% H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色lOmin，加5〇μL 0. 5Μ硫酸溶液终 止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出 多1/2 "平台OD值"对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为7.68X 109。 r ? 150000 X A
[_雜常数Μ抗傾始浓度 四、单抗反应特异性和应用效果 选择重组的Ki67蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免 疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法 在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore