一种抗CD3抗原和Her-2抗原的双特异性抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种双特异性抗体，属于多肽，更具体地，属于免疫球蛋白技术领 域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌在欧美国家及我国部分大城市已占女性恶性肿瘤的首位，目前常用的治疗 方式包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗等。乳腺癌是乳腺上皮发生恶性 肿瘤，其发病率占女性恶性肿瘤的第一位，在我国近年来发病率明显上升。随着诊疗水平 的不断提尚，5年生存率大为提尚，但仍有20%~30%的患者在手术治疗后复发、转移或死 亡。伴随着免疫科学的发展，免疫治疗成为乳腺癌治疗研宄的新领域。
[0003] 免疫治疗分为被动免疫和主动免疫两种。被动免疫是指将对疾病有免疫力的供者 的免疫应答产物或其人工制成物（抗体、免疫效应细胞、小分子免疫肽等）应用于肿瘤患 者，以发挥治疗疾病的作用，其典型例子是单克隆抗体赫赛汀（Here印tin)治疗Her-2受体 过表达乳腺癌的成功应用。赫赛汀是Her-2抗原的抗体，是最早应用于乳腺癌的单克隆抗 体。抗体主要通过抗体依赖的细胞毒作用（Antibody Dependent Cellular Cytotoxcity， ADCC)起到杀伤肿瘤细胞的作用。赫赛汀与Her-2细胞外域亚结构IV结合，阻止Her-2受 体同源和异源二聚化，一方面抑制Her-2的信号转导系统，另一方面可以激活ADCC效应杀 伤肿瘤细胞。曲妥珠单抗，对于Her-2阳性的乳腺癌患者，曲妥珠单抗联合其他化疗药物作 为辅助或者新辅助治疗已成标准方案。但是，它的治疗效果非常有限，因为66%至88%的 患者在接受治疗的第一年就会产生抗药性。此外，赫赛汀还会损害其它健康器官。另外，赫 赛汀需要和其它化疗药物，如紫杉醇联合用药才能提高患者的生存率。除此之外，另一种针 对Her-2的帕妥珠单抗和联合了曲妥珠单抗与美坦辛（Maytansine)的新型革El向药物T-DMl 经FDA批准也已经用于临床，但是这种药物需要通过共价连接的方式把抗体和药物连接起 来，生产工艺复杂，成本高。
[0004] 肿瘤免疫监视（Immune Surveillance)理论认为，癌前细胞或者癌细胞可以诱发 机体产生免疫反应，从而杀伤异型细胞或者癌细胞。激活的效应T细胞可以直接杀伤肿瘤 细胞，也可以通过分泌细胞因子诱导肿瘤细胞及其他基质细胞凋亡或者趋化巨噬细胞等实 现非特异性免疫杀伤。另一方面，癌细胞也存在免疫逃避机制，逃避免疫系统的杀伤，从而 有利于癌细胞的生长与转移，其中免疫抑制性细胞和分子如调节性T细胞（T regulatory cell，Treg)、髓源抑制细胞（Myeloid Derived Suppressor Cell，MDSC)、肿瘤相关巨细 胞和白细胞介素-6(11^61"16111^11-6，11^-6)等在这个过程中起到重要作用。因此，促进抗 原呈递细胞（Antigen Presenting Cells，APCs)的抗原呈递功能、T细胞的抗肿瘤效应以 及抑制肿瘤相关的免疫抑制因素是免疫治疗的主要策略。如过继性T细胞治疗（Adoptive T Cells Therapy)是将具有抗肿瘤效应的T细胞在体外培养扩增，再回输给相应的肿瘤患 者，发挥抗肿瘤免疫反应的作用。目前在转移性黑素瘤患者中，过继性T细胞治疗已取得了 明显疗效，但是在乳腺癌的治疗中还没有应用。
[0005] 双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗 原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别肿瘤 细胞抗原，诱导ADCC效应的同时，识别效应T细胞，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强 效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，如乳腺癌细胞的Her-2抗原和T细胞的CD3抗原。
[0006] 抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分 子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原 分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同 一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化 学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子 的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研宄发现，不同的 抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相 互契合，可以识别不同的抗原分子，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。
[0007] 基于现有技术中的单一识别在肿瘤治疗领域存在的问题，本发明意欲提供一种同 时针对肿瘤细胞和T细胞的双特异性抗体，在识别乳腺癌细胞的Her-2抗原，诱导ADCC效 应的同时，识别效应T细胞的CD3抗原，将T细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强效应T细胞 对肿瘤细胞的杀伤作用。
【发明内容】
[0008] 基于上述目的，本发明首先提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列相 同的轻链，两条序列不同的重链。
[0009] 所述轻链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 1第1-108位氨 基酸残基所示。其中，⑶Rl、⑶R2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1的第24-34 位、57-63位和89-96位氨基酸残基所示。
[0010] 在一个优选的技术方案中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第 109-214位氨基酸残基所示。
[0011] 所述第1条重链的可变区识别Her-2抗原，简称Her-2重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位氨基酸残基所示。其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO : 2的第26-33位、50-72位和97-109位氨基酸残基所示。
[0012] 在一个优选的技术方案中，所述第1条重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2 第116-450位氨基酸残基所示。
[0013] 所述第2条重链的可变区识别T细胞表面的⑶3抗原，简称⑶3重链，其⑶R1、 CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :3的第25-33位、38-61位和97-110位氨 基酸残基所示。
[0014] 在一个优选的技术方案中，所述第2条重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3 第1-116位氨基酸残基所示。
[0015] 在一个更为优选的技术方案中，所述第2条重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3第117-451位氨基酸残基所示。
[0016] 在免疫球蛋白可变区内，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比V区内其他区 域更易变化，这些区域称为高变区（Hypervariable Region HVR)，其余部分被称为框架区 (Frame Region)。高变区实际上是特异性抗原与免疫球蛋白结合的位置。由于这些高变 区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（Complementarity-Determining Region， CDR)，即CDR区。一条重链或轻链上的3个CDR区构成了抗体与抗原特异性结合的部位。本 领域技术人员可以根据上述CDR区序列，再配以保守性的框架区序列和恒定区序列，同样 可以达到本发明的发明效果，因此这些技术方案也同样在本发明的保护范围之内。
[0017] 其次，本发明还提供了一种能够表达和分泌上述抗体的宿主细胞，所述细胞含有 能够表达抗人Her-2抗原的抗体轻链的真核表达载体，能够表达抗人Her-2抗原的抗体重 链的真核表达载体，和能够表达抗CD3抗原抗体重链的真核表达载体，其特征在于，所述抗 人Her-2抗原的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :1第1-108位所示，所述抗人 Her-2抗原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位所示，所述抗⑶3抗 原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :3第1-116位所示。
[0018] 在一个优选的技术方案中，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链可变区的核苷酸编码 序列如SEQ ID NO :4第1-324位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链可变区的核苷 酸编码序列如SEQ ID NO :5第1-345位碱基所示，所述抗CD3抗原的抗体重链可变区的核 苷酸编码序列如SEQ ID NO :6第1-348位碱基所示。
[0019] 在一个更为优选的技术方案中，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链恒定区的核苷酸 编码序列如SEQ ID NO :4第325-642位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链恒定区 的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :5第346-1350位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体重链恒 定区的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :6第349-1353位碱基所示。
[0020] 优选地，所述真核表达载体为p⑶NA3. 0。
[0021] 更为优选地，所述宿主细胞为HEK293细胞。
[0022] 发明人分别对抗Herceptin抗原的抗体重链序列和抗⑶3抗原的抗体的重链序 列进行了突变，对于Here印tin抗体的重链