轻链全序列为SEQ ID NO :1，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第1-108位氨基酸残基所示，其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1的第24-34位、57-63位和89-96位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :1第109-214位氨基酸残基所示。
[0064] 2)Hec印tin抗体的重链全序列为SEQ ID NO :2,可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2第1-115位氨基酸残基所示，其中，⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :2的第26-33位、50-72位和97-109位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO :2第116-450位氨基酸残基所示。
[0065] 3)⑶3抗体的重链的全序列为SEQ ID NO :3,可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3 第1-116位氨基酸残基所示，其中⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :3 的第25-33位、38-61位和97-110位氨基酸残基所示，恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3第117-451位氨基酸残基所示。
[0066] 实施例2 :流式细胞仪技术（FACS)检测双特异性抗体的功能
[0067] 将培养的人乳腺癌BT474细胞首先用细胞刮刀从培养皿中刮下，将细胞置于有 5ml PBS缓冲液的50ml离心管中，用注射器的活塞挤压细胞制成单细胞悬液。离心收集细 胞。用50ml染色液重悬样本，进行细胞计数和活力分析；再次离心细胞，弃掉上清，重悬细 胞使其细胞数达到2 X IO7个/ml ;
[0068] 1)抗体的准备和孵育：
[0069] 用50ul染色液稀释纯化获得的双功能抗体至lug/ml，加入50ul细胞悬液（相当 于IO 6个细胞）于每个试管或孔中，轻轻混匀；避光冰浴30分钟。4°C离心沉淀细胞5分钟 (300-400g)，吸掉上清；用染色液重复洗涤细胞2次；加入IOOul用染色液稀释的FITC标记 的鼠抗人二抗（I :1000)，避光冰浴30分钟，然后用染色液洗涤细胞3次，弃上清，用IOOul 含有PI的染色液重悬细胞，进行FACS分析。
[0070] 取IOOul抗凝的人全血，加50ul染色液稀释的纯化获得的双功能抗体（lug/ml)， 然后加等体积2XRBC红细胞裂解液，室温避光放置10分钟，离心弃上清，用染色液洗涤细胞 3次，细胞用IOOul染色液稀释的FITC标记的鼠抗人二抗（I :1000)，避光冰浴30分钟，然 后用染色液洗涤细胞3次，弃上清，用IOOul含有PI的染色液重悬细胞，进行FACS分析。
[0071] 图8为本发明双特异性抗体的FACS分析结果图。图8A为BT474细胞FACS分析 结果，图8B为Jurka细胞FACS分析结果，如图所示，双特异性抗体可同时结合表达Her2抗 原的BT474细胞和表达CD3抗原的Jurkat细胞，而赫赛汀抗体只能结合BT474细胞。
[0072] 实施例3 :ADCC细胞毒性试验
[0073] 1.白细胞分离
[0074] 1)取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。
[0075] 2)将试管直立静置于室温或37°C温箱中30~60min，待红细胞自然沉降。此时可 见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白 色的白细胞层（正常人外周血白细胞）。
[0076] 3)用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；
[0077] 4)加入无 Ca2、Mg2Hank's液至离试管口 3cm处，混勾，以水平离心机2000r/min离 心lOmin，弃上清，同法再洗绦两次。
[0078] 5)沉淀细胞用适量10%~20%灭活小牛血清的Hank' s液重悬，计数，配成所需 的细胞浓度的悬液，一般常用2 X IO6/毫升。
[0079] 2.肿瘤细胞的培养
[0080] 人乳腺癌细胞MCF-7在含10%胎牛血清中的RPMI-1640培养基中培养至75 - 80%的密度，弃培养基，用预热至37度的PBS洗涤细胞2次，加2ml胰蛋白酶一 EDTA溶液， 室温放置5分钟，加2ml含10%胎牛血清的培养基终止反应，采用一次性的无菌吸管反复吹 打细胞至单细胞悬液，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，PBS再洗绦两次，计数 后，用培养基重悬细胞至2X10 6/毫升备用。
[0081] 3.细胞毒性试验
[0082] 取重悬肿瘤细胞10微升（2X104)，加入含0. 1 % BSA的RPMI-1640培养基30微升， 然后分别加入不同的抗体10微升（lmg/ml)，37度孵育30分钟，然后加入5X10 5(效应细 胞/靶细胞=25)?1^(：，体积为250微升，37度孵育4小时，以水平离心机20001'/1^11离心 lOmin，取上清采用Roche细胞毒性检测试剂盒检测上清中LDH的活性以换算成肿瘤细胞的 死亡程度，试剂盒的货号为：11644793001。结果如图9所示。
[0083] 如图9所示，纵坐标为T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤率，本发明提供的双特异性抗体 为柱1，其显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性，显示出了优异的细胞毒性， 杀伤率高达70 % (横坐标6种样本的杀伤率依次为70 %，64%，50 %，13 %，2 %，2 % )，高于 Her-2抗体和CD3抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用，这显示出本发明的双 特异性抗体在临床治疗Her-2抗原阳性的肿瘤的应用价值。
【主权项】
1. 一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列相同的轻链，两条序列不同 的重链，所述轻链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-108位氨基 酸残基所示，所述第1条重链的可变区识别Her-2抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO:2第 1-115位氨基酸残基所示，所述第2条重链的可变区识别T细胞表面的⑶3抗原，其⑶R1、 CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3的第25-33位、38-61位和97-110位氨 基酸残基所示。2. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO:1第109-214位氨基酸残基所示。3. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第1条重链恒定区的氨基酸序列如 SEQIDNO:2第116-450位氨基酸残基所示。4. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第2条重链可变区的氨基酸序列如 SEQIDNO:3第1-116位氨基酸残基所示。5. 根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述第2条重链恒定区的氨基酸序列如 SEQIDNO:3第117-451位氨基酸残基所示。6. -种能够表达和分泌权利要求1-5中任一所述抗体的宿主细胞，所述细胞含有能 够表达抗人Her-2抗原的抗体轻链的真核表达载体，能够表达抗人Her-2抗原的抗体重链 的真核表达载体，和能够表达抗CD3抗原抗体重链的真核表达载体，其特征在于，所述抗人 Her-2抗原的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-108位所示，所述抗人Her-2 抗原的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2第1-115位所示，所述抗CD3抗原的抗 体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:3第1-116位所示。7. 根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述抗人Her-2抗原的抗体的轻链可变区 的核苷酸编码序列如SEQIDNO:4第1-324位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链 可变区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:5第1-345位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体重 链可变区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:6第1-348位碱基所示。8. 根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述抗人Her-2抗原的抗体轻链恒定区的 核苷酸编码序列如SEQIDNO:4第325-642位碱基所示，所述抗人Her-2抗原的抗体重链 恒定区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:5第346-1350位碱基所示，所述抗⑶3抗原的抗体 重链恒定区的核苷酸编码序列如SEQIDNO:6第349-1353位碱基所示。9. 根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述真核表达载体为pCDNA3. 0。10. 根据权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种双特异性抗体，所述抗体带有2条相同的轻链序列和2条不同的重链序列，可以分别识别乳腺癌细胞表面的Her-2抗原和T细胞表面的CD3抗原。所述双特异性抗体能够显著增强抗体介导的T细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性。
【IPC分类】A61P35/00, C07K16/30, C07K16/46, C12N5/10
【公开号】CN104892765
【申请号】CN201510368641
【发明人】宋海鹏, 李敏, 王庆东
【申请人】长春力太生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日