用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品的制作方法
【专利说明】用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年11月15日提交的美国临时申请No. 61/904,951的利益。上 述申请的全部教导通过引用并入本文。
[0003] 通过引用并入ASCII文本文件中的材料
[0004] 本申请通过引用并入在与本申请同时提交的以下ASCII文本文件中包含的序列 表：
[0005] a)文件名：序列表.txt ;建立于2014年10月28日，大小38KB。
[0006] 发明背景
[0007] 原发性肝癌在全世界是男性中第五常见的癌症和在女性中是第七常见的癌症。在 全球范围内，它是男性中癌症死亡的第二位的主要原因和在女性中癌症死亡的第六位的主 要原因。肝细胞癌（HCC)占原发性肝癌的85%。HCC在东南亚和撒哈拉以南非洲中是地方 病。西方国家中的发病率在近年中提高并预期继续提高。HCC在美国对于男性和女性是癌 症死亡的第五位和第九位的主要原因。HCC的五年总生存率仅为15%。
[0008] 鉴于这一疾病的高发病率及其对患者、其支持系统和大多数社团造成的巨大负 担，迫切地需要患有中期和晚期疾病的HCC患者的治疗中的进一步改善一更特别地，存在 着对于可以发生特异性地靶向HCC肿瘤且例如减小肿瘤的体积以治疗HCC和/或消除肿瘤 的药剂以及制备和使用该药剂的方法的需要。
【发明内容】
[0009] 本发明特别地提供特异性地靶向HCC肿瘤的血管内皮细胞和治疗HCC的药剂以及 使用这些药剂的相关方法。在第一方面中，本发明提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物， 其中所述抗体特异性地结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。
[0010] 在一些实施方式中，凝结剂是凝血蛋白。在更特别的实施方式中，凝血蛋白是组织 因子（tissue factor)。在还更特别的实施方式中，组织因子包含与SEQ ID NO: 1具有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；例 如，与SEQ ID N0:1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性；例如，与SEQID NO: 1具有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。
[0011] 在相关的方面中，本发明提供包含通过肽键与抗体偶联的具有与SEQ ID NO: 1至 少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列的 组织因子的偶联物，其中所述抗体特异性地结合人PLVAP蛋白的细胞外结构域中的表位。
[0012] 在前述任何方面和实施方式中，哺乳动物PLVAP蛋白可以包含与SEQ ID N0:2具 有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；更 优选与SEQ ID N0:2具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，还更优选与SEQ ID N0:2具有至95、96、97、98、99%或更高同一性。
[0013] 对于前述任何方面和实施方式，所述抗体可以特异性地结合选自 PPAGIPVAPSSG(SEQ ID N0:25)或 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM(SEQ ID N0:26)的表位。 在更特别的实施方式中，所述抗体特异性地结合表位PPAGIPVAPSSG(SEQ ID N0:25)。
[0014] 对于前述任何方面和实施方式的偶联物，在一些实施方式中，凝血蛋白和抗体化 学交联。在其它实施方式中，凝血蛋白和抗体通过肽键连接。
[0015] 在前述任何一个方面和实施方式的偶联物中，抗体可以是包含轻链可变区和重链 可变区的免疫球蛋白。在更特别的实施方式中，凝血蛋白和抗体通过在包含重链可变区的 蛋白质的羧基末端与凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。在其它实施方式中，凝血蛋白 和抗体通过在包含轻链可变区的蛋白质的羧基末端与凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连 接。
[0016] 在一些实施方式中，在前述任何一个方面或实施方式的偶联物中，凝血蛋白和抗 体经由接头肽通过肽键连接。在更特别的实施方式中，接头肽包含（Gly 4-Ser)n，其中η是 1、2、3、4、5或6 ;更优选其中η是3。
[0017] 在特定实施方式中，前述任何一个方面或实施方式的偶联物中，抗体是包含以下 的免疫球蛋白：
[0018] i)包含含有SEQ ID ΝΟ:3的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含含 有SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列的可变区中的⑶R的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变 区和重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换；或
[0019] ii)包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含 含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列的可变区中的⑶R的轻链可变区，任选地其中所述轻链可 变区和重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换。
[0020] 在更特别的实施方式中，轻链可变区和/或重链可变区是人源化的。在还更特别 的实施方式中，轻链可变区和重链可变区由以下给出：
[0021] i)选自SEQ ID N0:7、8、9、10或11的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区 是SEQ ID NO: 11;和选自SEQ ID NO: 12、13或14的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可 变区是SEQ ID NO: 13 ;或
[0022] ii)选自SEQ ID N0:15、16、17、18或19的重链可变区，更特别地其中所述重链可 变区是SEQ ID NO: 19;和选自SEQ ID N0:20、21或22的轻链可变区，更特别地其中所述轻 链可变区是SEQ ID N0:22。
[0023] 前述任何方面和实施方式的特定实施方式中，偶联物包含与SEQ ID NO: 23具有至 少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列。
[0024] 在相关的方面中，本发明提供编码前述任何一个方面和实施方式的偶联物的核 酸。在特别的实施方式中，本发明提供的核酸包含在载体中。在相关的实施方式中，载体可 以是在宿主细胞中，且在特定的实施方式中，宿主细胞是细菌细胞（例如大肠杆菌）。在其 它实施方式中，宿主细胞是真核细胞（例如，真菌如酵母，包括芽殖酵母；昆虫细胞如SfO、 Sf21或high five细胞；或哺乳动物细胞如CHO、VERO或COS细胞）。
[0025] 在另一个相关的方面中，本发明提供包含前述任何方面和实施方式的偶联物的药 物组合物，其中该组合物进一步包含合适的载体、赋形剂和/或造影剂。在更特别的实施方 式中，该组合物为适合施用于受试者的剂型。
[0026] 在另一个方面，本发明提供通过在支持前述任何一个方面和实施方式的宿主细胞 表达偶联物的条件下培养所述宿主细胞并分离表达的偶联物来制备前述任何一个方面和 实施方式的偶联物的方法。
[0027] 在再另一个实施方式中，本发明提供在需要的哺乳动物受试者中治疗具有PLVAP 阳性脉管系统的肿瘤、治疗肝细胞癌（HCC)、减小具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的体积或 者诱导具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的血栓形成和肿瘤坏死的方法。在这些方法中，向 受试者（例如，人）提供（例如，通过任何合适的方式施用）治疗有效量的前述任何一个方 面和实施方式的偶联物或前述任何一个方面和实施方式的药物组合物。
[0028] 在一些实施方式中，HCC肿瘤体积在所述偶联物诱导的血栓形成和肿瘤坏死后减 小。
[0029] 在特定实施方式中，偶联物血管内施用到受试者的肿瘤，例如HCC。在更特别的实 施方式中，偶联物直接输注到一个或多个给肿瘤供血的动脉中。
[0030] 在一些实施方式中，受试者同时或顺序经受一种或多种化疗剂、放射疗法、肿瘤内 酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治疗。在更特别的实施方 式中，偶联物与一种或多种化疗剂一起施用于受试者。在更特别的实施方式中，一种或多种 化疗剂包括治疗有效量的过索拉非尼（参见，例如PubChem 216239)、贝伐单抗或其它抗血 管生成（antiangeogenic)治疗药。在特定实施方式中，偶联物在进一步包含一种或多种化 疗剂的药物组合物中施用于受试者。
[0031] 在一些实施方式中，偶联物以约5-约200 μ g/cm3肿瘤，更特别地约10-约150 μ g/ cm3肿瘤和更特别地约15-约100 μ g/cm 3肿瘤的剂量施用。
[0032] 在特定实施方式中，偶联物以单一剂量施用。在其它实施方式中，偶联物以2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多个剂量施用。在更特别的实施方式中，所述剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10天或者1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月或更长时间段内施用。
[0033] 附图简要说明
[0034] 本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的图形。具有彩色图形的本专利或专 利申请公开的拷贝在请求和支付必要费用时由专利局提供。
[0035] 前述内容从如附图中显示的本发明以下示例实施方式的更详细说明来看是清楚 的。
[0036] 图1是电泳凝胶的照片，其显示纯化的带GST标签的人组织因子蛋白的SDS-PAGE 分析。使用10%聚丙烯酰胺凝胶。3微克的带GST标签的重组人组织因子（GST-hTF)加载 到凝胶上。
[0037] 图2是随蛋白质浓度变化的OD 405nm的曲线图，通过酶联免疫分析证明与人 组织因子化学偶联的MECA32(MECA32-hTF)与人PLVAP的结合。分析板的各孔涂覆有小 鼠 PLVAP蛋白的水溶性细胞外结构域。在封闭后，涂覆的孔与提高浓度的MECA32-hTF - 起孵育。一个孔与人组织因子（hTF) -起孵育。MECA32-hTF与PLVAP的结合用来自R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)的生物素化抗-hTF抗体和来自 Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL)的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物检测。结果显示MECA32-hTF结合小鼠 PLVAP并携带可用抗-hTF抗体检测的hTF。没有抗体的对照可溶性hTF(实心圆）不能结 合PLVAP和被检测。
[0038] 图3A和3B是显示MECA32-Fab-TF表达载体的构建的示意图。
[0039] 图4是CSR02-Fab_TF的表达构建体的示意图。
[0040] 图5是重组人PLVAP和小鼠 PLVAP的SDS-PAGE的照片。重组人PLVAP (5 μ g)和 小鼠 PLVAP(2. 5 μ g)用12%聚丙烯酰胺凝胶进行分析。
[0041] 图6A和6B是显示SCID小鼠的H印3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞中PLVAP 表达的免疫组织化学（IHC)染色的显微照片。MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体（10 μ g/ ml)用于IHC染色（图B)。左图是用作为阴性对照的相同浓度正常大鼠 IgG染色的相同块 的切片（图A)。结果显示H印3B肿瘤异种移植物的血管内皮细胞与人HCC -样对于PLVAP 表达阳性染色（图B中通过箭头所指的黑棕色沉淀）。肿瘤血管内皮细胞表达的PLVAP因 此可以被靶定以评估MECA32-TF和MECA32-Fab-TF的治疗效果。相同的血管不能用对照大 鼠 IgG染色（图A中的箭头）。
[0042] 图7显示通过超声检查获得的肿瘤中血流的照片，其表明与重组人组织因子偶联 的抗-PLVAP MECA32单克隆抗体（mAb) (MECA32-TF)对肿瘤血流的影响。肿瘤血流用3D能 量多普勒（Power Doppler)超声检查评估。能量多普勒检查在治疗前48小时和治疗后48 小时进行。结果显示血流在用20 μ g MECA32-TF处理的组中显著变小（白色箭头）但在用 24 μ g MECA32 mAb处理的对照组中没有变小。红色血流信号在处理前存在于肿瘤内部。
[0043] 图8是肿瘤体积随时间的线图，其表明MECA32-TF输注对肿瘤生长的影响。该图中 显示的结果来自图7中描述的相同试验。携带H印3B肿瘤异种移植物的SCID小鼠通过输 注20yg MECA32-TF到给肿瘤供血的动脉中进行处理。对照组用24yg MECA32 mAb处理。 肿瘤体积在第〇天处理之前和之后使用3D超声检查监测。对照组中的小鼠之一在初次处 理后第20天由于快速发展的肿瘤生长而死亡(f)。处理组和对照组的生长率使用线性混合 效应模型进行比较并显著不同（P = 0. 0002)。该研宄的结果（图7和8)证明与组织因子 偶联的抗-PLVAP抗体能够阻断肿瘤血流并有效地抑制肿瘤生长。实心圆（·）：MECA32mAb 对照（η = 3);交叉（X) :MECA32-TF 处理组（η = 3)。
[0044] 图 9 是提供重组抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF 和抗-人 PLVAPCSR02-Fab-TF 偶 联物的结构示意图的图片。两种抗-PLVAP Fab-TF之间的主要差异在于在MECA32-Fab-TF 的κ轻链的C末端具有组氨酸标签（His-标签）。引入组氨酸标签用于纯化目的。 CSR02-Fab-TF不需要组氨酸标签来进行纯化。
[0045] 图10是相对于竞争抗体浓度的OD 405nm的线图，其通过竞争酶联免疫分析表明 MECA32-Fab-TF结合小鼠 PLVAP。ELISA板的孔涂覆重组的水溶性小鼠 PLVAP (2. 5 μ g/ml) 过夜。在用含有牛血清白蛋白的缓冲液封闭孔后，提高浓度的大鼠 IgG(0. 5 μ g/ml-50 μ g/ ml)、MECA32-Fab-TF(0· 5 μ g/ml-50 μ g/ml)或 MECA32 mAb(0· 05 μ g/ml-5 μ g/ml)与 0. 25 μ g/ml的生物素化MECA32 mAb -起孵育。生物素化MECA32 mAb与PLVAP的结合用链 霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物和显色底物测量。结果显示MECA32 mAb和MECA32-Fab-TF 两者可以与生物素化MECA32 mAb竞争结合小鼠 PLVAP，大鼠 IgG对照不结合竞争结合小鼠 PLVAP。如所预期的，MECA32 mAb对于与小鼠 PLVAP的结合具有比MECA32-Fab-TF高一个 数量级的效力，因为MECA32-Fab-TF的结合亲和力比MECA32 mAb低一个数量级。
[0046] 图11是显示通过MECA32-Fab-TF (3、6和12 μ g)和对照MECA32单克隆抗体 (12 μ g)诱导H印3B肿瘤异种移植物肿瘤坏死的一组显微照片。在输注MECA32-Fab-TF或 MECA32 mAb到给肿瘤供血的动脉中后，肿瘤异种移植物在处理后72收获并送交组织学切 片。显示的显微照片对于所有三个不同剂量的MECA32-Fab-TF显示肿瘤的大量坏死（以粉 红色突出显示的区域）。其余区域的有活性肿瘤组织以蓝色突出显示。来自对照组的所有 三个肿瘤是100%有活性的，如右栏所示。处理的肿瘤的坏死区域通过衡量全肿瘤图象和坏 死区域的剪切块来计算，并以百分比表示。肿瘤边界用红线和蓝描画轮廓。各处理组中有 二只小鼠。
[0047] 图12是显示通过MECA32-Fab-TF(2. 5、5和10 μ g)和对照MECA32单克隆抗体 (IOyg)诱导ifep3B肿瘤异种移植物肿瘤坏死的一组显微照片。本研宄与图11中所示的 相似。主要差别是用于处理Hep3B肿瘤异种移植物的剂量。同样，肿瘤在输注到给肿瘤供 血的动脉中后72小时收获并送交组织学切片。各组中有两只小鼠。同样，结果显示处理后 所有三个剂量下的显著肿瘤坏死。以粉红色突出显示的各处理肿瘤中的坏死区域如图11 中所描述的以总肿瘤切片的百分比确定。肿瘤边界用红线和蓝线描画轮廓。方块区域放大 (40x和IOOx)并显示在右侧以显示残留的存活肿瘤细胞（箭头）。各肿瘤中显示的百分比 是相对于肿瘤总截面的相对坏死面积。
[0048] 图13A和13B是显示输注10 μ g MECA32-Fab-TF后2、4、24、48和72小时肿瘤组 织学的变化的显微照片组。切片用苏木精和曙红染色。在图13A中，血管中纤维蛋白血栓 块的出现（箭头）在输注后2小时观察到。含有纤维蛋白血栓块的血管的数目在之后变得 更突出（箭头）。在处理前（〇小时）肿瘤血管中没有观察到纤维蛋白血栓块。在48和72 小时肿瘤组织变得完全坏死。显微照片以IOOx放大率获取。在图13B中，肿瘤细胞显示在 处理后4小时彼此之间具有增大的清晰空间的轻微分离。这一变化在24小时变得更显著。 具有蓝色核染色损失的明确坏死在处理后48小时变得明显，并在72小时变得更显著。显 微照片以200x放大率获取。
[0049] 图14是通过超声检查获得的肿瘤血流的一组照片，其显示输注IOyg MECA32-Fab-TF后不同时间点肿瘤血流的改变。肿瘤血流在处理前和处理后通过3D能量多 普勒评估。各时间点有两只小鼠。小鼠在处理后的3D能量多普勒研宄后立即处死。此处 显示具有来自处理前和处理后的各时间点的两只小鼠之一的能量多普勒信号（红色）的声 谱图。处理前48小时收集的肿瘤的声谱图显示在左侧。处理后声谱图显示在右侧，其中肿 瘤血流信号在处理后2小时消失并持续直到处理后72小时。
[0050] 图15是肿瘤体积随时间的线图，其显示动脉内输注MECA32-Fab-TF对H印3B肿瘤 异种移植物生长的作用。携带H印3B人肝细胞癌异种移植物的SCID小鼠在第0天用单次 输注的10 μ g对照MECA32单克隆抗体（mAb)和5或10 μ g MECA32-Fab-TF处理。肿瘤体 积从第0天的处理开始的_2、9和24天使用3D超声检查测量。在第-2天对于MECA32mAb 对照组和两个MECA32-Fab-TF处理组（10和5