植物的SCID小鼠用动脉内输注的10 μ g MECA32-Fab-TF(n = 4)或10 μ g MECA32单克隆抗体（η = 2)治疗。肿瘤生长用3D超声检查 监测。当ΗΕΡ3Β肿瘤生长到大约2000立方毫米时，处死携带肿瘤的小鼠。这一研宄允许我们 评估治疗组中肿瘤生长的延迟。图17中总结的结果显示在单次输注10 μ gMECA32-Fab-TF 到给肿瘤供血的动脉中后存在肿瘤生长的显著延迟。治疗组中的肿瘤与对照小鼠相比多 花费42天生长到1600mm3。对照组和治疗组之间肿瘤生长到1600mm 3的平均天数分别是 9. 8±3. 0 天和 51. 8±3· 2 天（图 17)。
[0214] 总之，这两项不同研宄的结果进一步证实抗-PLVAP-Fab-TF输注到给肿瘤供血的 动脉中有效地诱导肿瘤坏死和控制肿瘤生长。
[0215] 抗-PLVAP-Fab-TF的系统性施用对肿瘤生长的作用
[0216] 为了了解MECA32-Fab_TF通过外周静脉的系统性施用是否也可以实现相同的治 疗效果，我们将10 μ g或20 μ g的MECA32-Fab-TF注射到携带HEP3B肿瘤异种移植物的 SCID小鼠的尾静脉中并监测注射后的肿瘤生长。对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水注射。各治疗 组具有三只小鼠。表17中总结的结果显示，当MECA32-Fab-TF通过尾静脉施用时，对肿瘤 体积没有统计学显著的效果。因此，抗-PLVAP MECA32-Fab-TF输注到给肿瘤供血的动脉中 是诱导肿瘤坏死和实现治疗效果必需的。有可能MECA32-Fab-TF的系统性施用导致注射的 MECA32-Fab-TF的稀释和在到达肿瘤血管前MECA32-Fab-TF与其它器官（例如，肺、肾和胃 肠器官）的血管内皮细胞上的PLVAP结合。
[0217] 抗-人PLVAP Fab-TF的产生和表征
[0218] 为了 了解相似的治疗剂是否可以针对人PLVAP产生，使用针对存在于人PLVAP 羧基末端的氨基酸序列PPAGIPVAPSS中的抗原性表位的人源化抗-人PLVAP单克隆抗 体。这一人源化抗-人PLVAP单克隆抗体是先前开发的并描述于美国专利申请公开 No. US20110262349A1 中。这一抗-人 PLVAP-Fab-TF 偶联物命名为 CSR02-Fab-TF (图 9)。 我们然后进行一系列研宄以比较CSR02-Fab-TF与MECA32-Fab-TF的组织因子特异性活 性和与靶PLVAP的结合亲和力。我们的研宄结果显示抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF表现 为与抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF相比具有每毫克抗-PLVAP Fab-TF的更高TF活性 且CSR02-Fab-TF和MECA32-Fab-TF两者具有相似的结合亲和力（表1)。该发现表明， CSR02-Fab-TF如MECA32-Fab-TF -样可以以足够的亲和力结合其PLVAP靶标且携带足以启 动血液凝结的TF活性以实现治疗效果。
[0219] 表 L 抗-人 PLVAP CSR02-Fab-TF 和抗-小鼠 PLVAP MECA32-Fab-TF 之间每毫克 抗-PLVAP Fab-TF的组织因子（TF)特异性活性和与PLVAP的结合亲和力的比较。
[0220]
[0222] 如表1中总结的，研宄了三个不同批次的CSR02-Fab_TF和六个不同批次的 MECA32-Fab-TF。结果显示两种Fab-TF具有相似的结合亲和力。然而，CSR02-Fab-TF具有 比MECA32-Fab-TF更高的特异性TF活性。结果指示，CSR02-Fab-TF具有足够的结合亲和 力和组织因子特异性活性以实现如MECA32-Fab-TF-样的治疗肝细胞癌的治疗效果。
[0223] 基于我们的Hep3B异种移植物模型中治疗时的平均肿瘤体积和有效诱导肿瘤坏 死所需的MECA32-Fab-TF剂量，我们估计抗-PLVAP-Fab-TF通过输注到给肿瘤供血的动脉 中以治疗HCC的有效治疗剂量为每毫升（立方厘米）15 μ g-100 μ g。
[0224] 为进一步证明产生的CSR02-Fab_TF可以结合人HCC的血管内皮细胞，我们使 CSR02-Fab-TF生物素化并使用这一 Fab-TF研宄其与人HCC的血管内皮细胞的结合。我们的 研宄结果显示生物素化的CSR02-Fab-TF事实上结合HCC的血管内皮细胞且不结合非肿瘤 性肝组织的血管内皮细胞（图18)。这一研宄的结果证实CSR02-Fab-TF如MECA32-Fab-TF 一样可通过输注到给肿瘤供血的动脉中用于治疗患者的HCC。
[0225] 基于PLVAP在HCC的血管中和不在非肿瘤性肝组织中差异表达的知识，我们开发 了用于通过共表达抗-PLVAP单克隆抗体或其Fab片段上的人组织因子蛋白治疗HCC的新 的治疗剂。我们证明携带人组织因子的可溶性细胞外结构域的完整抗体及其Fab片段事实 上都可以在单次输注到给肿瘤供血的动脉中后诱导肿瘤坏死和抑制肿瘤生长。
[0226] 因为可溶性组织因子与抗-PLVAP抗体的化学偶联不能再现地控制相同数目组织 因子在相同位点与各抗体交联，因此我们建立重组的具有Fd链的羧基末端的抗-PLVAP 单克隆抗体Fab片段共表达人组织因子细胞外结构域，并使用这一重组蛋白作为治疗HCC 的治疗剂。为证明这种治疗剂事实上可以用于治疗HCC，首先建立携带源自HEP3B人肝 细胞癌细胞系的肿瘤的SCID小鼠并用于概念验证（proof-of-conc印t)研宄。我们然 后使用MECA32抗-小鼠 PLVAP杂交瘤产生抗-PLVAP-Fab-TF的小鼠形式。有必要开发 抗-PLVAP-Fab-TF的小鼠形式，因为生长到人HCC异种移植物中的血管来源于小鼠并表达 小鼠 PLVAP。我们表达抗-PLVAP Fab-TF的人和小鼠形式上的人组织因子，因为人组织因 子可以激活小鼠凝血因子VII并在小鼠中诱导血液凝结。我们进行的CSR02-Fab-TF和 MECA32-Fab-TF之间的对比研宄确认它们都可以以足够的亲和性结合其PLVAP靶标并携带 足够的组织因子活性以触发血液凝结和实现治疗效果。
[0227] 我们的研宄结果证明我们开发的重组抗-PLVAP-Fab-TF具有用于在将这一新型 治疗剂直接输注到给肿瘤供血的动脉中而非经外周静脉的系统性静脉内施用后通过触发 肿瘤血管中血凝块的形成、阻断肿瘤血流和诱导肿瘤坏死来治疗HCC的治疗效果。本申请 中描述的研宄也证实抗-人PLVAP单克隆抗体或其Fab片段共表达组织因子蛋白可以用于 治疗显示PLVAP表达限制于肿瘤血管的肿瘤（如成胶质细胞瘤）。
[0228] 应当理解，对于本申请中描述一些参数的所有数字边界限定，如"约"、"至少"、"小 于"和"大于"，所述描述也必然地包括以所述值为界的任何范围。因此，例如，至少1、2、3、 4或5的描述也尤其记述1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5和4-5的范围等。
[0229] 对于本文中引用的所有专利、申请或其它参考文献，如非专利文献和参照序列信 息，应当理解其为所有目的以及对于所引用的主题通过引用并入。在其中通过引用并入的 文献和本申请之间存在冲突的情况中，以本申请为准。与本申请中公开的参照基因序列相 关的所有信息，如Gene ID或登录号（通常指NCBI登录号），包括例如基因组基因座、基因 组序列、功能注释、等位基因变体及参照mRNA(包括，例如，外显子边界或反应元件）和蛋 白质序列（如保守结构域结构、Homologene类目等等）以及化学基准（例如，Pub Chem化 合物、Pub Chem物质或Pub Chem Bioassay类目，包括其中的注释如结构和分析等等），通 过引用全文并入本文。
[0230] 用于本申请中的标题仅为方便的目的而不影响本申请的解释。
[0231] 本发明提供的各方面的优选特征可加以必要变更以应用于本发明的所有其它方 面，且通过（不限于）从属权利要求示例，并且也包括本发明特定实施方式和方面（包括工 作实施例）的单个特征（例如，元件，包括数值范围和示例性实施方式）的组合和排列。例 如，工作实施例中示例的特定实验参数可以适应用于要求保护的发明点而不脱离本发明。 例如，对于所公开的材料，尽管这些化合物的各不同单个化合物及总体的组合和排列中的 特定指称可以不明确地公开，但其在本文中各自具体地设想和描述。因此，如果元素 A、B 和C的类以及元素 D、E和F的类和元素 A-D的组合实例被公开，则即使各元素未单独地阐 述，则其各自单独地或总体地设想到。因此，在这一实例中，特别地设想组合a-e、a-f、b-d、 B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的各组合并应当认为其从A、B和C ;D、E和F及示例组合A-D的 公开中公开。类似地，这些中的任何亚集或组合也特别地设想和公开。因此，例如，A-E、B-F 和C-E的亚组特别地设想到并应当认为其从A、B和C ;D、E和F及示例组合A-D的公开中 公开。这一概念适用于本申请的所有方面，包括物质组合物的元素和制备或使用该组合物 的步骤。
[0232] 如本领域普通技术人员按照本说明书的教导所认识的，本发明的前述方面可以以 任何组合或排列主张以达到相对于现有技术新颖和非显而易见的程度一因此在一个元素 在本领域普通技术人员已知的一篇和多篇参考文献中描述的情况下，它们可以特别地通过 特征或特征组合的否定式限制或放弃从所要求保护的发明中排除。
[0233] 尽管本发明特别地参照其示例实施方式显示和描述，本领域技术人员理解，可以 对其进行形式和细节的各种改变而不脱离所附权利要求涵盖的本发明的范围。
【主权项】
1. 一种包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中所述抗体特异性地结合哺乳动物 PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。2. 如权利要求1的偶联物，其中所述凝结剂是凝血蛋白。3. 如权利要求2的偶联物，其中所述凝血蛋白是组织因子。4. 如权利要求3的偶联物，其中所述组织因子包含与SEQIDNO: 1具有至少40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列；更优选与5￡0IDN0:1具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性；还更优选与5￡0 1〇勵：1具 有至少95、96、97、98、99%或更高同一性。5. -种包含通过肽键与抗体偶联的组织因子的偶联物，该组织因子与SEQIDNO: 1具 有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，其中所述 抗体特异性地结合人PLVAP蛋白的细胞外结构域中的表位。6. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述哺乳动物PLVAP蛋白包含与SEQIDNO:2 具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列； 更优选与SEQIDN0:2具有至少80、85、90、95、96、97、98、99%或更高同一性，还更优选与 SEQIDN0:2 具有至 95、96、97、98、99%或更高同一性。7. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体特异性地结合选自PPAGIPVAPSSG或 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM的表位。8. 如权利要求7的偶联物，其中所述抗体特异性地结合表位PPAGIPVAPSSG。9. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体化学交联。10. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过肽键连接。11. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体是包含轻链可变区和重链可变区的 免疫球蛋白且其中所述凝结剂是凝血蛋白。12. 如权利要求11的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过在包含重链可变区的蛋白 质的羧基末端与所述凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。13. 如权利要求11的偶联物，其中所述凝血蛋白和抗体通过在包含轻链可变区的蛋白 质的羧基末端与所述凝血蛋白的氨基末端之间的肽键连接。14. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述凝结剂是凝血蛋白且所述凝血蛋白与抗 体经由接头肽通过肽键连接。15. 如权利要求14的偶联物，其中所述接头肽包含（Gly4-Ser)n，其中n是1、2、3、4、5 或6;更优选其中n是3。16. 前述权利要求任一项的偶联物，其中所述抗体是包含以下的免疫球蛋白： i) 包含含有SEQIDN0:3的氨基酸序列的可变区中的CDR的重链可变区和包含含有 SEQIDN0:4的氨基酸序列的可变区中的CDR的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变区和 重链可变区在各CDR中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换；或 ii) 包含含有SEQIDN0:5的氨基酸序列的可变区中的⑶R的重链可变区和包含含有 SEQIDN0:6的氨基酸序列的可变区中的CDR的轻链可变区，任选地其中所述轻链可变区和 重链可变区在各⑶R中具有最多1、2、3或4个保守氨基酸置换。17. 如权利要求16的偶联物，其中所述轻链可变区和/或重链可变区是人源化的。18. 如权利要求17的偶联物，其中所述轻链可变区和重链可变区由以下给出： i) 选自SEQIDN0:7、8、9、10或11的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区是SEQ IDNO: 11;和选自SEQIDNO: 12、13或14的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可变区是 SEQIDNO:13 ;或 ii) 选自SEQIDNO: 15、16、17、18或19的重链可变区，更特别地其中所述重链可变区 是SEQIDNO: 19;和选自SEQIDN0:20、21或22的轻链可变区，更特别地其中所述轻链可 变区是SEQIDNO:22。19. 如权利要求14的偶联物，其中所述偶联物包含与SEQIDNO:23具有至少80、85、 90、95、96、97、98、99%或更高同一性的氨基酸序列。20. -种药物组合物，包含前述权利要求任一项的偶联物，其中该组合物进一步包含合 适的载体、赋形剂和/或造影剂。21. 如权利要求20的药物组合物或如权利要求1-19任一项的偶联物，其为适合施用于 受试者的剂型。22. -种核酸，其编码权利要求1-8或10-19任一项的偶联物。23. -种载体，其包含权利要求22的核酸。24. -种宿主细胞，其包含如权利要求23的载体或如权利要求22的核酸。25. 如权利要求24的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，更特别地其中所述细 菌细胞是大肠杆菌。26. 如权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞是选自真菌如酵母，包括芽殖酵母；昆虫 细胞如SfO、Sf21或highfive细胞；或哺乳动物细胞如CH0、VER0或COS细胞的真核细胞。27. -种制备权利要求1-8或10-19任一项的偶联物的方法，包括在支持权利要求 24-26任一项的宿主细胞表达所述偶联物的条件下培养所述宿主细胞和分离所表达的偶联 物。28. -种在需要的哺乳动物受试者中治疗具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤、减小具有 PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的体积或者诱导具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤的血栓形成和 肿瘤坏死的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-19任一项的偶联物或 权利要求20或21的药物组合物。29. 如权利要求28的方法，其中所述肿瘤是HCC且HCC肿瘤体积在施用所述偶联物后 通过血栓形成和坏死来减小。30. 如权利要求28或29的方法，其中所述受试者是人。31. 如权利要求28-30任一项的方法，其中所述偶联物血管内施用到所述受试者的肿 瘤。32. 如权利要求28-31任一项的方法，其中所述偶联物直接输注到一个或多个给肿瘤 供血的动脉中。33. -种在需要的人类受试者中治疗HCC的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量 的权利要求1-19任一项的偶联物或权利要求20或21的药物组合物，其中所述偶联物或组 合物直接输注到一个或多个给肿瘤供血的动脉中。34. 如权利要求28-33任一项的方法，其中所述受试者同时或顺序经受一种或多种化 疗剂、放射疗法、肿瘤内酒精注射、手术、冷冻疗法、射频消融或前述一种或多种的组合的治 疗。35. 如权利要求34的方法，其中所述偶联物与一种或多种化疗剂一起施用于所述受试 者。36. 如权利要求35的方法，其中所述一种或多种化疗剂包括治疗有效量的过索拉非 尼、贝伐单抗或其它抗血管生成治疗药。37. 如权利要求35的方法，其中所述偶联物在进一步包含所述一种或多种化疗剂的药 物组合物中施用于所述受试者。38. 如权利要求28-37任一项的方法，其中所述具有PLVAP阳性脉管系统的肿瘤是成胶 质细胞瘤。39. 如权利要求28-38任一项的方法，其中所述偶联物以约5-约200yg/cm3肿瘤，更 特别地约10-约150yg/cm3肿瘤和更特别地约15-约100yg/cm3肿瘤的剂量施用。40. 如权利要求28-39任一项的方法，其中所述偶联物以单一剂量施用。41. 如权利要求28-39任一项的方法，其中所述偶联物以2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多 个剂量施用。42. 如权利要求41的方法，其中所述多个剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者1、 2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月或更长时间段内施用。
【专利摘要】一种用于治疗肝细胞癌的治疗性生物制品。本发明特别地提供包含与抗体偶联的凝结剂的偶联物，其中所述抗体特异性地结合哺乳动物PLVAP蛋白的细胞外结构域表位。这些试剂特异性地靶向HCC肿瘤并治疗HCC。本发明还提供使用这些偶联物的方法，如通过施用本发明提供的偶联物或本发明提供的组合物如药物组合物治疗HCC的方法。PTA-996320090408PTA-996420090408
【IPC分类】C12N15/62, C12P21/00, A61K38/36, C07K19/00, A61P35/00, A61K47/48
【公开号】CN104892767
【申请号】CN201410648801
【发明人】高国彰, 王芸馨
【申请人】中国合成橡胶股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年11月14日
【公告号】CA2871114A1, EP2915545A1, US20150140021