ID N0:31)，和
[0117] 铰链接头反向引物：
[0118] 5' AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3' （SEQ ID N0:32)。
[0119] 接下来，我们使用克隆的hTF cDNA模板和以下引物对通过PCR制备由（Gly4Ser)3 接头序列和人组织因子细胞外结构域（AA. 33-251) (hTF)组成的cDNA :
[0120] hTF接头正向引物：
[0121] 5' GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG3' （SEQ ID NO:33)，和
[0122] TF 反向引物：5'CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3'（SEQ ID NO:34)。
[0123] 两种PCR产物通过重叠延伸连结。最终的融合PCR产物插入到pET_26b载体中。 这一载体命名为 pET26b-M32-Fd-TF (图 3A)。
[0124] 第四步：含MECA32 Fd-铰链-(Gly4Ser)3接头-TF和具有His-标签的MECA32 κ 轻链两者的双顺反子质粒载体的构建
[0125] 我们使用pET26b-M32-Fd-TF作为模板和以下引物对通过PCR产生DNA片段：
[0126] 26b-RBS-F:
[0127] 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' （SEQ ID NO:35)，和
[0128] 26b-终止-R:
[0129] 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' （SEQ ID NO:36)。
[0130] 这一 DNA片段包括核糖体结合序列（rbs)、MECA32 mAb重链的VHl和CH1、铰链区、 接头序列、hTF和终止密码子。这一片段然后插入pET26b-M32K的Xba I限制性位点中。整 个插入片段的序列使用染料-脱氧（dye-deoxy)方法通过DNA测序验证。这一质粒构建体 命名为 pET26b MECA32-Fab-TF (图 3B)并转化到大肠杆菌 SHuffle T7Express 菌株（New England Biolabs Corp.)中用于蛋白质表达。总结用于产生MECA32_Fab_TF的这一双顺序 子质粒表达载体的构建步骤的示意图显示于图3A和3B中。
[0131] MECA32抗-小鼠 PLVAP单克隆抗体的Fab共表达人组织因子（MECA32-Fab-TF)的 产生
[0132] 为产生MECA32-Fab-TF，新鲜大肠杆菌培养物的集落（l-2mm)在30°C，230rpm下接 种到含有30 μ g/ml卡那霉素的4ml 2xYT培养基中过夜。第二天早晨，过夜培养物接种到 含有30μg/ml卡那霉素的400ml 2χΥΤ培养基中并继续在30°C，250rpm下生长。当600nm 的吸光度达到~〇. 6-0. 8时，添加异丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG)到0. 4mM的最 终浓度用于诱导重组蛋白质产生。振摇在30°C下持续约20h。
[0133] 细胞通过在室温下以1000 Ox g离心20min收获并用于分离包涵体。细胞浆悬浮在 4ml 含有 150mM NaCl、ImM MgCl2、0. 17mg/mlPMSF 和 2mg/ml 鸡蛋清溶菌酶（Sigma)的 IOmM Tris/HCl, pH 7. 5中。添加 Benzonase (250单位；EM Science)且悬浮液在室温下温和地混 合1. 5小时，然后以12000x g离心15min。沉淀重悬浮在含有ImMEDTA和3% Nonidet P40 的 IOmM Tris/HCl，pH 7.5(2ml)中，以 50%功率超声处理 Imin 并以 12000g离心 20min。沉 淀重悬浮在水中，以50%功率超声处理20-30秒并以12000g离心20min。重复用水洗涤， 且高度富集包涵体的最终沉淀通过在室温下温和混合过夜而悬浮在含有6M盐酸胍、0. 5M NaCl、20mM磷酸盐和IOmM 2-巯基乙醇的缓冲液，pH 8中。溶液保持在室温下过夜，然后 在6M尿素/50mMTris/HCl，pH 8中稀释到约lmg/ml的蛋白质浓度并在4°C下针对10-20 体积的相同缓冲液透析过夜。然后，透析改变到含2M尿素、50mM Tris/HCl、300mM NaCl、 2.5mM GSH、0.5mM GSSG的缓冲液，pH 8(折叠缓冲液）中。在透析2天后，缓冲液用新鲜的 折叠缓冲液替换且透析再继续2天。接下来，透析缓冲液改变为IM尿素、50mM Tris-HCl、 300mM NaCl的缓冲液，pH8且透析再继续一天。透析然后在具有顺序降低的尿素浓度的相 同缓冲液中进行，〇. 8M尿素6小时，0. 56M尿素过夜和0. 28M尿素6小时。最后，透析在没 有尿素的折叠缓冲液中进行并持续过夜。重折叠的上清液加载到氮川三乙酸镍（Ni-NTA ;GE Healthcare)柱上并用 50mM 磷酸钠和 0· 3M NaCl，pH 7. 0 中的 500mM immidazol 洗脱。重 组 MECA32_Fab_TF 进一步通过 HiLoadl6/60Superdex 75 制备级（GE Healthcare)凝胶过 滤柱色谱纯化。含靶MECA32-Fab-TF的洗脱液通过SDS-PAGE分析并合并。MECA32-Fab-TF 通过ELISA表征以确认与小鼠 PLVAP的结合。MECA32-Fab-TF的组织因子特异性活性使用 显色TF分析测量。
[0134] 用于表达重组CSR02抗-人PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达水溶性人组织因 子（CSR02-Fab-TF)的质粒构建体的开发
[0135] 我们也产生与MECA32-Fab-TF类似的重组抗-人PLVAP CSR02-Fab-TF蛋白。这 一蛋白质基于抗-人PLVAP mAb CSR02开发。这一重组蛋白质的结构基本上类似于如上所 述的MECA32-Fab-TF，除了不同的Ab结构域和在κ轻链的羧基端不存在His-标签外。除 去His-标签，因为his-标签不是CSR02-Fab-TF的纯化所需的。CSR02-Fab-TF通过使用 抗-人 κ 轻链KappaSelect 亲和柱色谱（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 纯化。CSR02mAb是抗人PLVAP的人源化单克隆抗体。
[0136] 用于制备产生CSR02-Fab_TF的质粒构建体的过程类似于制备用于 MECA32-Fab-TF的质粒构建体而具有一些改变。先前对于克隆cDNA以获得抗体重链和轻 链5' -端的DNA序列所描述的第一步省略，因为CSR02mAb重链和轻链的cDNA序列是早已 知道的。因此，仅需要三个步骤来制备CSR02-Fab-TF表达构建体。这三个步骤描述如下。
[0137] 第一步：CSR02 mAb轻链cDNA插入pET26b质粒载体中
[0138] 来自产生CSR02 mAb的NSO细胞系的总RNA使用寡-dT作为引物反转录为cDNA。 CSR02的κ轻链cDNA使用寡-dT引发的cDNA作为模板和以下所示的引物对通过PCR产 生：
[0139] CSR02-VK3F-26b F Nde I 正向引物：
[0140] 5'TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA 3' （SEQ ID NO:37)
[0141] κ-R-26b_Not I 反向引物：
[0142] 5，GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG 3, （SEQ ID NO:38)。
[0143] 纯化的CSR02mAb轻链的PCR DNA片段然后插入质粒载体pET26b的Nde I和Not I位点中以产生pET26b-cVK3。
[0144] 第二步：插入有用于表达由CSR02 mAb的VHUCHl和铰链区加上（Gly4Ser)3接头 区域和人组织因子的细胞外结构域（AA. 33-251) (hTF)构成的融合多肽的cDNA的pET26b 质粒构建体的构建
[0145] 这一质粒使用从NSO细胞系制备的cDNA和克隆的人组织因子cDNA作为模板通过 PCR构建。以下的引物对用于PCR :
[0146] I)用于CSR02mAb重链的VHl-CHl-铰链区和接头区域的引物对：
[0147] VH5-pro26b-NdeI_F 正向引物：
[0148] 5'TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG 3' （SEQ ID N0:39)，和
[0149] 铰链接头R:
[0150] 5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC 3' （SEQ ID NO:40).
[0151] II)用于接头序列-hTF-加用于插入的限制性位点的引物对：
[0152] hTF 接头 F:
[0153] 5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG 3' （SEQ ID N0:41)
[0154] hTF R-Not I:
[0155] 5'GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG 3' （SEQ ID N0:42)。
[0156] 从如上所述的这两个PCR反应产生的PCR片段进一步融合并通过重叠延伸进行扩 增。融合的cDNA插入pET26b质粒载体中，其命名为pET26b-VH5-Fd-TF。
[0157] 第三步：含用于CSR02 mAb Fd-铰链-(Gly4Ser)3接头-TF和CSR02 mAb κ轻链两 者的cDNA的双顺反子质粒载体的构建
[0158] 我们使用作为模板的pET-26b-VH5-Fd-TF和以下引物对通过PCR产生DNA片段：
[0159] 26b-RBS-F:
[0160] 5'ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' （SEQ ID N0:43)，和
[0161] 26b-终止-R:
[0162] 5'CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' （SEQ ID N0:44)。
[0163] 扩增的DNA片段包括核糖体结合位点（rbs) ;CSR02重链的VHl、CHl和铰链序列； 接头序列；可溶性人组织因子；和终止密码子。这一 DNA插入pET26b-cVK3载体的Xba I位 点中以得到新的双顺反子质粒载体，命名为pET26b CSR02-Fab-TF(图4)。这一质粒用于 在单一启动子的控制下表达κ轻链和融合重链。整个插入片段的序列使用染料-脱氧方 法通过DNA测序验证。
[0164] 重组CSR02抗-人PLVAP单克隆抗体的Fab片段共表达水溶性人组织因子 (CSR〇2_Fab_TF)的产生
[0165] 重组 CSR02_Fab_TF 蛋白质的表达。大肠杆菌 Shuffle T7Express (New England Biolabs)的转化通过将感受态细胞与pET-26b CSR02-Fab-TF质粒DNA -起在冰上孵育 5min，在42°C水浴中精确地加热30秒和随后置于冰上2分钟来进行。在接种到选择性培养 基上之前，转化体在30°C下孵育，同时与SOC培养基（0. 5%酵母提取物、2%胰蛋白酶化蛋 白胨、IOmM NaCl、2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM 葡萄糖）以 250rpm 振摇 60min。 CSR02-Fab-TF的表达在30°C或37°C下用0. 05mM的异丙基-β -D-硫代半乳吡喃糖苷诱导 16小时。在诱导后，细菌细胞在室温下在溶菌酶和Benzonase核酸酶存在下通过具有0. 2% Tween 80的lx PBS进行裂解2小时。细胞裂解产物通过在4°C下以1000 Orpm离心30分 钟收获。收集上清液并过滤以分离可溶性部分。
[0166] CSR02_Fab_TF 通过 KappaSelect 和 Capto AdhereMmultimodal 柱色谱纯化。 KappaSelect柱（Iml)用磷酸盐缓冲盐水（PBS)，pH 7. 4(0.0 lM磷酸盐缓冲液，0.0027M KC1，0. 14M NaCl)平衡。含有CSR02-Fab-TF的大肠杆菌细胞裂解产物以lml/min的流率加 载。在应用样品后，柱用平衡缓冲液洗涤直到0D280降低到基线。结合的蛋白质的其余部 分用含有〇. 25M蔗糖的0.1 M甘氨酸缓冲液，pH 2. 7洗脱。洗脱液立即通过添加每1ml洗 脱液50 μ 1的IM Tris-基础缓冲液，pH 9. 0调节到生理pH。
[0167] 从KappaSelect 柱洗脱的 CSR02-Fab-TF进一步用 20mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 预平 衡的 Capto Adhere 柱（5ml)纯化。从 KappaSelect 柱洗脱的 CSR02-Fab_TF 样品用 20mM Tris缓冲液，pH 7. 5稀释50倍并随后以lml/min的流率加载到Capto Adhere柱上。在应 用样品后，柱用平衡缓冲液洗涤直到0D280降低到基线。结合的CSR02-Fab-TF蛋白然后用 含有200mM NaCl的20mM Tris缓冲液，pH 7. 5洗脱。
[0168] 可溶性重组人和小鼠 PLVAP蛋白（hPLVAP和mPLVAP)的产生
[0169] (hPLVAP)的产生。质粒 pGEM'T Easy - hPLVAP51_442通过插入代表截 短的PLVAP (构成小鼠 PLVAP细胞外结构域的氨基酸残基51-442)的PCR片段到 pGEM?-T Easy载体（Promega)中产生。这一 PCR片段使用以下引物对通过PCR从人 PLVAP(NM_031310)的 cDNA 克隆（OriGene, Rockville, MD)产生：
[0170] 5' - |CATATG| aACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3' (SEQ ID NO:45)，和
[0171] 5? - 0GATCC| TGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3? (SEQ ID NO: 46)。
[0172] 为构建质粒pET-15b-hPLVAP51-442以产生重组PLVAP蛋白，在末端具有Ndel/Bam HI识别序列（加框的序列）的编码PLVAP的氨基酸残基51-442的cDNA片段从pGEM?-T Easy - hPLVAP51_442切割并插入pET-15b (Novagen)中。上述表达构建体通过DNA测序验证 并转化到大肠杆菌（R〇setta_gami2(DE3)pLysS)(EMD Millipore Corp.)中。
[0173] 如以下所述产生和纯化带His-标签的hPLVAP融合蛋白。来自新鲜培养物的转化 的大肠杆菌的集落（l -2mm)在37°C下以230rpm接种到含有100 μ g/ml氨节青霉素、34 μ g/ ml氯霉素、12. 5 μ g/ml四环素的4ml TB培养基中过夜。过夜培养物接种到含有100 μ g/ ml氨苄青霉素、34 μ g/ml氯霉素、12. 5 μ g/ml四环素的400ml TB培养基中并在37°C下以 250rpm继续生长。当600nm的吸光度达到约0. 6~0. 8时，添加异丙基β -D-I-硫代半乳 吡喃糖苷（IPTG)到I. 66mM的最终浓度以诱导蛋白质产生。在30°C下继续振摇约20h。细 胞通过在4°C下以1000 Og离心30分钟收获。细胞沉淀重悬浮在12ml补充有8M尿素的平 衡-洗涤缓冲液（50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7，10mM imidazol)中并储存在-20°C下至 少2小时。解冻的样品超声处理10秒，各次超声处理之间具有30秒中断以降低粘度直到 其变成透明的。细胞悬浮液在4°C下以10, 000 - 12, OOOx g离心20min以使任何不溶性材 料成团。来自前一步骤的上清液应用于用补充有8M尿素的10倍柱体积平衡-洗涤缓冲液 平衡的TALON树脂柱（Clontech)。在用10-20倍柱体积的IX平衡-洗涤缓冲液洗涤柱后， 重组的带聚组氨酸标签的人PLVAP蛋白质用5倍柱体积的含6M尿素的洗脱缓冲液（50mM 磷酸钠、300mM NaCl，pH 7、500mM imidazol)洗脱。洗脱液中纯化的重组蛋白质在4°C下 针对含3M尿素的IX平衡/洗涤缓冲液透析至少4小时，然后缓冲液改变为含IM尿素的 IX平衡-洗绦缓冲液并在4°C下透析至少4小时。蛋白质浓度用Bradford染料结合分析 (Bi〇-Rad，Hercules，CA)测定。蛋白质然后在23°C下用每mg重组PLVAP蛋白1单位生物 素化凝血酶（Novagen)消化16小时以除去聚组氨酸-标签。生物素化凝血酶通过固相链 霉亲和素-琼脂糖从孵育除去。所得的重组水溶性人PLVAP (hPLVAP)针对没有尿素的IX 平衡-洗涤缓冲液（50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7)透析。测定蛋白质浓度且蛋白质通过 SDS-PAGE分析纯度（图5)。
[0174] mPLVAP(小鼠 PLVAP)的产生。质粒 pGEM-T Easy-mPLVAP48_438通过插入代表 截短的PLVAP (构成小鼠 PLVAP的细胞外结构域的氨基酸残基48-438)的PCR片段到 pGEM^'-T Easy载体（Promega Corp.)中而产生。这一 PCR片段使用以下引物对通过 PCR 从小鼠 PLVAP 的 cDNA 克隆（Invitrogen, Life Technologies Corp.)制备：
[0175] mPLVA