一种海洋真菌爪曲霉溴代缩酚环酸醚类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于微生物发酵物提取技术领域，具体地，涉及一种海洋真菌爪曲霉溴代缩酚酸环醚类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

目前在临床治疗中发现病原微生物的耐药性越来越强，尤其是耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌（MRSA）、铜绿假单胞菌（俗称绿脓杆菌）和白色假丝酵母（俗称白色念珠菌）造成的感染越来越严重，很多传统抗生素已基本丧失疗效，因此有必要寻找新型的抗生素来应对此挑战。此外，在农业生产因为过度使用各种化学合成农药，造成严重的食品、土壤及水污染，并经过食物链危及人体健康和生态平衡，农药残留也严重阻碍了我国的农产品出口；而生物农药具有不易产生抗药性、对非靶生物安全、环境友好且易于自然降解等优点，对于人类健康、环境保护及农业可持续发展具有重要的意义。海洋真菌来源的抗生素及杀虫剂具有易于大规模发酵生产、高效、易于克服抗药性等优点，易于实现药源稳定供给，具有较好的经济、社会与环境效益。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有抗生素及杀虫剂的缺陷和不足，提供一种提取自海洋真菌爪曲霉的溴代缩酚酸环醚类化合物，该化合物具有抗真菌、抗细菌活性和杀虫活性，在制备抗真菌剂、抗细菌剂及农用杀虫剂中具有广泛的应用前景。

本发明的目的是提供一种海洋真菌爪曲霉溴代缩酚酸环醚类化合物。

本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述化合物的应用。

本发明的上述目的是用过以下技术方案给予实现的。

本发明采用的海洋真菌爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372菌种，于2009年10月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.3372，株号为DLEP2008001。

一种海洋真菌爪曲霉（Aspergillus unguis）溴代缩酚酸环醚类化学物，其特征在于，所述化学物的化学结构式如（）所示：

（）

上述海洋真菌爪曲霉溴代缩酚酸环醚类化学物的制备方法包括如下步骤：

S1. 发酵：将爪曲霉DLEP2008001接种于真菌培养基中静置发酵后，分别收集菌丝体和发酵液；；

S2. 粗提：将步骤S1的发酵液经乙酸乙酯萃取后浓缩，菌丝体经有机溶剂提取后浓缩，合并后得粗提物；

S3. 分离纯化：将步骤S2的粗提物进行硅胶柱梯度层析，经硅胶薄层层析检测，将含有目标物质的洗脱组分继续进行硅胶柱、凝胶柱层析和正相制备液相色谱分离纯化得到目标化合物；

其中，步骤S1所述真菌液体培养基的配方为：每升中含有如下组分：土豆汁400～600 mL，NaBr 15～25g，蔗糖15～25g，纯水或自来水400～600 mL。

优选地，所述真菌液体培养基的配方为：每升中含有如下组分：土豆汁500 mL，NaBr 20 g，蔗糖20 g，纯水或自来水500 mL。

具体地，上述海洋真菌爪曲霉溴代缩酚酸环醚类化学物的制备方法包括如下步骤：

S1. 发酵：将爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372接种于真菌液体培养基中静置发酵，发酵2～4天后，加入终浓度为0.5～2 mM（优选1mM）的普鲁卡因溶液，继续发酵18～22天，过滤，分别收集菌丝体和发酵液；

S2. 粗提：将步骤S1获得的发酵液经乙酸乙酯萃取并浓缩，将步骤S1获得的菌丝体用有机溶剂提取并浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物；

其中，所述有机溶剂为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种；

S3. 分离纯化：a. 将步骤S2获得的粗提物经硅胶柱层析，用石油醚-二氯甲烷或石油醚-氯仿进行预洗脱，继而用氯仿-甲醇或二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，收集以洗脱液体积比100:0～100:1梯度的洗脱的组分；组分特征为硅胶薄层层析板上展开剂为体积比15:1的氯仿-甲醇溶液展开下，比移值为0.29～0.74的混合物组分；

b. 将步骤a收集的洗脱组分再进行硅胶柱层析，洗脱液为体积比5:1的石油醚-丙酮；

c. 将步骤b收集的洗脱组分进行葡聚糖凝胶柱层析，洗脱液为甲醇，流速0.5～0.7 mL/min；

d. 将步骤c收集的洗脱组分进行正向制备液相色谱纯化，洗脱液为体积比3～5:1（优选4:1）的氯仿-石油醚，在硅胶柱填充20～30g（优选25 g）硅胶、流速2～4 mL/min（优选3 mL/min）情况下，收集保留时间为14～28 min的组分；

e. 将步骤d收集的洗脱组分继续进行正向制备液相色谱纯化，洗脱液为纯氯仿，在硅胶柱填充10～15g（优选12 g）硅胶、流速1～3 mL/min（优选2mL/min）情况下，收集保留时间为14～35 min的主峰，得到收集物。

优选地，步骤a或b所述硅胶柱层析的硅胶为200～300目。

另外，具体地，所述溴代缩酚酸环醚类化合物在薄层色谱上的比移值及化学显色特征如下：层析展开剂为纯氯仿时，所述化合物在GF254薄层硅胶板上的Rf值为0.26，254nm紫外线照射下呈单个、均匀的黑色～暗蓝色斑点，茴香醛硫酸显色为棕褐色。

优选地，所述化合物在高效液相分析条件下保留时间为4.0～5.0 min的单一色谱峰。

更优选地，所述高效液相色谱分析条件为Acquity UPLC®BEH C18柱，填料粒径1.7微米，柱尺寸2.1 mm×50 mm，流动相为添加万分之一体积的改性剂甲酸的乙腈水溶液，0～2.5 min乙腈比例为60%，2.5～2.6 min乙腈比例线性升至100%，2.6～3.0 min乙腈比例为100%，3.0～3.1 min乙腈比例线性降至60%，3.1～5.0 min乙腈比例为60%，流速0.3 ml/min。

优选地，所述溴代缩酚酸环醚类化合物在常温常压下为无色针晶。

经抗菌实验得出，本发明所述化合物对白色假丝酵母的MIC值为6.4 µmol/L，具有抑制白色假丝酵母的活性；对铜绿假单胞菌的MIC为1.6 µmol/L，表明该化合物具有抑制铜绿假单胞菌生长的活性；对耐甲氧基青霉素的金黄色葡萄球菌的MIC值为25.6 µmol/L，具有抑制MRSA的活性；对卤虫的半致死剂量LC50为12.0 µmol/L，表明其具有杀虫活性。

所以，上述溴代缩酚酸环醚类化学物在抗真菌、抗细菌或杀虫上的应用，以及在制备抗真菌剂、抗细菌剂或杀虫剂中的应用，都应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述真菌为白色假丝酵母。

优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌。

更优选地，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞杆菌。

另外，更优选地，所述细菌为铜绿假单胞杆菌或耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌。

优选地，所述虫为农业害虫。

更优选地，所述农业害虫为卤虫、线虫、甜菜夜蛾、蚜虫、库蚊幼虫或朱砂叶螨等害虫。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明获得了一种新的海洋真菌爪曲霉溴代缩酚酸环醚类化合物，具有良好的抗真菌、抗细菌活性与杀虫活性，而且化合物制备方法简单，易于大规模生产，在制备抗真菌剂、抗细菌剂或农用杀虫剂中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述溴代缩酚酸环醚类化合物的核磁共振氢谱。

图2为本发明所述溴代缩酚酸环醚类化合物的核磁共振碳谱。

图3为本发明所述溴代缩酚酸环醚类化合物的ESI^-质谱。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明所述海洋真菌爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372菌种，于2009年10月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.3372，株号为DLEP2008001。

实施例1 海洋真菌溴代缩酚酸环醚类化合物的制备方法

1. 发酵

将爪曲霉（Aspergillus unguis）CGMCC No.3372接种于真菌液体培养基中静止发酵，发酵2天后，加入终浓度为1mM的普鲁卡因溶液，继续发酵20天，过滤，分别收集菌丝体和发酵液。

其中，所述真菌液体培养基的配方为：

每升中含有如下组分：土豆汁500 mL，NaBr 20 g，蔗糖20 g，纯水或自来水500 mL。

2. 粗提

将步骤1获得的发酵液经乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，得浓缩液。同时将步骤1获得的菌丝体用有甲醇提取液提取三次，减压浓缩，得浓缩液。将所得浓缩物合并，即为粗提物；

3. 分离纯化

a. 将步骤2获得的粗提物经硅胶柱层析，用石油醚-氯仿进行预洗脱，继而用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集以洗脱液体积比100:0～100:1梯度的洗脱的组分；组分特征为硅胶薄层层析板上展开剂为体积比15:1的氯仿-甲醇溶液展开下，比移值为0.29～0.74的混合物组分；

b. 将步骤a收集的洗脱组分再进行硅胶柱层析，洗脱液为体积比5:1的石油醚-丙酮；

c. 将步骤b收集的洗脱组分进行葡聚糖凝胶柱层析，洗脱液为甲醇，流速0.5～0.7 mL/min；

d. 将步骤c收集的洗脱组分进行正向制备液相色谱纯化，洗脱液为体积比4:1的氯仿-石油醚，在硅胶柱填充25 g硅胶、流速3 mL/min情况下，收集保留时间为14～28 min的组分；

e. 将步骤d收集的洗脱组分继续进行正向制备液相色谱纯化，洗脱液为纯氯仿，在硅胶柱填充12 g硅胶、流速2 mL/min情况下，收集保留时间为14～35 min的主峰；所收集目标物质还符合下述特征：

（1）TLC检测收集在254nm紫外线照射下呈单个、均匀的黑色～暗蓝色斑点，茴香醛硫酸显色为棕褐色的物质；

（2）在检测用的薄层层析条件下Rf值为0.26的物质；所述的检测用薄层层析板为GF254硅胶板，展开剂为纯氯仿；

（3）在检测用的超高效液相分析条件下保留时间为4.36 min的单一色谱峰的组分；所述的检测用高效液相色谱分析条件为Acquity UPLC®BEH C18柱，填料粒径1.7微米，柱尺寸2.1 mm×50 mm，流动相为添加万分之一体积的改性剂甲酸的乙腈水溶液，0～2.5 min乙腈比例为60%，2.5～2.6 min乙腈比例线性升至100%，2.6～3.0 min乙腈比例为100%，3.0～3.1 min乙腈比例线性降至60%，3.1-5.0 min乙腈比例为60%，流速0.3 ml/min。

4、经上述分离过程得到的化合物，确定为纯化合物。

经波谱分析，结构鉴定结果显示，其为一种溴代缩酚酸环醚类天然产物，结构式如（I）所示：

。

（I）

该化合物具有以下理化和波谱特性：

无色针晶，核磁共振氢谱 (¹H NMR，CDCl₃, 500 MHz) δ6.76 (s), 5.38 (q, 6.8), 2.46 (s), 2.33 (s), 1.95 (s) , 1.82 (dd, 6.8, 1.0)，如图1所示。

核磁共振碳谱(¹³C NMR，CDCl₃, 125 MHz) δ162.0 (s), 160.2 (s), 156.5 (s), 148.8 (s), 145.3 (s), 142.9 (s), 142.5 (s), 136.1 (s), 132.1 (s), 128.1 (d), 116.1 (s), 115.3 (d), 114.5 (s), 108.0 (s), 99.6 (s), 21.7 (q), 17.9 (q), 14.5 (q), 10.6 (q)，如图2所示。

ESI^-质谱显示准分子离子峰[M-H]-的同位素峰簇质荷比为m/z 481/483/485，其峰强度为1：2：1，为典型的二溴代特征且与分子式C₁₉H₁₇O₅Br₂相符，如图3所示。

实施例2 溴代缩酚酸环醚类化合物的抑真菌活性实验

1、白色假丝酵母（Candida albicans）是一种常见的条件致病真菌，可侵犯人体许多部位，引起皮肤念珠菌病、粘膜念珠菌病（鹅口疮、口角炎、阴道炎最常见）以及内脏及中枢神经念珠菌病，是最常见的真菌病。临床症状错综复杂，急缓不一。近年来随着抗生素、激素、免疫抑制剂的大剂量应用，以及器官移植术的开展，念珠菌病发病率渐趋增高，并可危及生命造成严重后果。该菌已成为抗真菌药物研发的重要针对目标。

2、实验方法：

采用国际标准的微量肉汤稀释法（National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Reference methed for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: approved standard M27-A, 7th ed. NCCLS, Wayne, Pa.）测定化合物对白色假丝酵母的最小抑菌浓度（MIC值）。

同时设置对照组：两性霉素B。

3、实验结果：

结果显示，上述实施例1获得的该溴代缩酚酸环醚类化合物对白色假丝酵母的MIC值为6.4 µmol/L，具有显著的抑制白色假丝酵母的活性。

而且，两性霉素B对白色假丝酵母的MIC值为12.8 µmol/L，本发明溴代缩酚酸环醚类化合物对白色假丝酵母的抑制活性显著强于阳性对照两性霉素B。

实施例3 溴代缩酚酸环醚类化合物的抑革兰氏阴菌活性实验

1、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，是一种条件致病菌，也是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。该菌常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。其引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。而且，随着广谱抗生素、激素以及免疫抑制剂的广泛临床使用，铜绿假单胞菌已对多种抗生素快速产生了耐药性，使得临床的抗感染治疗显得越来越困难。目前，针对该菌的药物研发也是抗生素研发的一个重点。

2、实验方法：

采用国际标准的微量肉汤稀释法（National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Approved standard M7–A6.）测定该化合物对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC值）。

3、实验结果：

上述实施例1获得的该溴代缩酚酸环醚类化合物对铜绿假单胞菌的MIC为1.6 µmol/L，表明该化合物具有很好的抑制铜绿假单胞菌生长的活性。

实施例4 溴代缩酚酸环醚类化合物的抑革兰氏阳性耐药菌活性实验

1、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是非常常见的病菌，有时候它会进入人体内而引起感染。这种感染轻微的会在皮肤上长疮和丘疹，严重的则可引起肺炎或血液感染。对葡萄球菌引起的感染通常用青霉素类的抗生素甲氧西林治疗，在大部分情况下非常有效。但是有些葡萄球菌菌株对甲氧西林形成了抗药性，也就是耐甲氧基青霉素的金黄色葡萄球菌（methicillin—resistant Staphylococcus aureus, MRSA）。1961年在英国发现了首例MRSA，之后以惊人的速度在世界范围内蔓延，是临床最常见的革兰氏阳性耐药细菌，据估计每年大约有十万人因为感染MRSA而住院治疗,也是新抗生素研发的重要靶标病原微生物。

2、实验方法：

采用国际标准的微量肉汤稀释法（National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Approved standard M7–A6.）测定化合物对耐甲氧基青霉素的金黄色葡萄球菌（MRSA）的最小抑菌浓度（MIC值）。

3、实验结果：

上述实施例1获得的该溴代缩酚酸环醚类化合物的MIC值为25.6 µmol/L，具有很好的抑制MRSA的活性。

实施例5 溴代缩酚酸环醚类化合物的杀虫活性实验

1、卤虫（brine shrimp）又称盐水丰年虫，属节肢动物门、甲壳纲、无甲目、盐水丰年虫科、卤虫属，是一种具有较高经济价值的鱼类饵料生物，也是一种对于毒素较为敏感的重要实验动物，其实验室培养的2~3龄幼虫可用于评价杀虫剂的活性强弱。

2、杀虫活性实验方法（详见申请人论文Toxicology Mechanisms and Methods, 2012, 22(1), 23~30）。

3、卤虫孵化与收集：经过室内自然光刺激复苏的冻存卤虫卵加入一个双室连通器式培养装置的孵化池中培养，连通器中盛有天然粗海盐配制的海水（30 g/L），卵投放量为1 g/L，先关闭连通器通道。经28℃下约2000勒克斯光照24小时孵化后，开启连通器通道，并将孵化池遮光，而收集池保持光照12~24 h，进行光诱导；然后关闭连通器通道，用开口光润的移液枪头吸取收集池中的卤虫幼虫进行后续试验。

4、卤虫生物致死法：将样品在96孔板中用无水甲醇连续倍半稀释成系列浓度，真空干燥除去有机溶剂，每孔加入200微升卤虫幼虫悬液（含20~30只虫体），并设置空白对照组，28℃培养24 h后在双目体视显微镜下计数每孔中幼虫总数及死亡数，计算每孔的校正死亡率，

校正死亡率=（对照组死亡率—处理孔死亡率）/对照组存活率×100%；

以校正死亡率—浓度的log2对数做图，在线性较好的10%~90%死亡率区间取线性趋势线，计算半致死剂量LC50。

5、实验结果：

上述获得的该溴代缩酚酸环醚类化合物的半致死剂量LC50为12.0 µmol/L，表明其具有杀虫活性。

而且，硫酸铜对卤虫的LC50为102.4 µmol/L，溴代缩酚酸环醚类化合物对卤虫的杀虫活性强于阳性对照硫酸铜。

另外，研究显示，该化合物对线虫、甜菜夜蛾、蚜虫、库蚊幼虫或朱砂叶螨等害虫，都有较好的杀虫活性。