专利名称：：海洋溴酚化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及治疗恶性肿瘤的药物，具体地说是海洋溴酚类化合物的制备方法、药理活性、用途及药学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物；该化合物及其衍生物作为蛋白质酪氨酸激酶(prafe/"^row'打e^we，PTK)抑制剂，可用于治疗各种高表达C-hY受体的恶性肿瘤。
背景技术：
：随着分子肿瘤学的发展，抗肿瘤药物的研究也从传统的细胞毒药物趋向作用于分子靶点的新型药物。蛋白酪氨酸激酶(PTK)是癌症治疗的标靶之一，原癌基因C-W是HZ4猫科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于4号染色体长臂上，编码145-165kDa跨膜受体(CD117)，具有酪氨酸激酶活性。它的产物是m型酪氨酸蛋白激酶生长因子受体，其结构类似于巨噬细胞集落刺激因子和血小板衍生物生长因子受体，属免疫球蛋白超家族成员，具有胞外5个免疫球蛋白样类似结构的配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区。在正常组织中，C-hY蛋白在肥大细胞、间质细胞、黑素细胞和乳腺上皮细胞表达。C-h'H言号通路的自分泌和旁分泌刺激参与人肿瘤的发生，并在多种肿瘤中起到癌基因的作用。C-^/蛋白是生长因子和干细胞因子(SCF)受体，它和配体干细胞因子间的相互作用可激活内在的酪氨酸激酶，随之使细胞内蛋白磷酸化，导致细胞内信号传导途径的激活。原癌基因C-^疾变会引起C-W蛋白的胞外段或胞内段发生变化，导致C-h'漲白受体持续开放，各种底物蛋白不断自身磷酸化，使得调节细胞分化、增殖、凋亡、趋化和粘附等特性的传导信号级联释放并扩大，通过该途径促进了细胞生长，抑制了细胞凋亡，细胞正常生物学特性消失而发展为肿瘤细胞。C-to的致癌潜能已经在许多实验中得到证实，Hines等发现，转染了C-W的MCF-7乳腺癌细胞系在培养基中的生长及增殖速率增快，而且这种增殖可被抗C丄Y抗体所阻抑；Camana等对转染了C-W基因的重组NIH3T3成纤维细胞进行培养，发现C-hY的活化可促进细胞增殖并且产生一个变异的表现型，这已经在细胞克隆及裸鼠肿瘤模型中得到了证实。近年来，越来越多的研究者研究关于把C-yb'f受体作为分子靶治疗高表达C-ZbY受体的肿瘤，寻找小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂，从而开发高效的新型抗癌药物。从现代药物研究开发的历史可见，每次创新药物的开发应用，首先来自某类新型天然先导化合物的发现，海洋是生命的起源地，在海洋独特的生态环境中，大多海藻能产生一些很有特色的活性物质。发明人从一种海洋红藻中得到一个结构新颖的溴酚类化合物，活性测试表明其对PTK酶有很强的抑制活性，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治，包括胃肠道间质瘤(GIST)、肥大细胞增生型白血病、生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、急性白血病、成神经细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌和乳腺癌等。
发明内容本发明目的是提供了一类海洋溴酚类药物在制备治疗高表达C-kit受体恶性肿瘤药物中的应用，溴酚化合物及其盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为7种具有蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制活性的海洋溴酚类化合物及其药物学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治。溴酚化合物分别为化合物I3,4-二溴-5-(乙氧基甲基)-l,2-二苯酚(中文)，3,4-dibromo-5-(ethoxymethyl)-1,2—benzenediol(英文)、化合物II4,4'-亚甲基-二(5，6-二溴-l,2-二基酚)(中文)，4,4'-methylenebis[5,6-dibromo-1,2-benzenediol](英文)、化合物HI3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基—5—(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4，5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(methoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)、化合物IV3-溴-4,5-二fe基-苯甲醛(中文)，3-bromo-4,5-dihydroxy-benzaldehyde(英文)、化合物V3-溴-4-[2,3-二溴-4，5-二羟基苯萄甲基-5-(羟甲基)-1,2-二苯酚(巾t)，3-bromo-4誦[2,3-dibromo誦4,5-dihydroxyphenyl]methy1—5-(hydroxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)、化合物VI二(2,3-二溴-4，5-二羟基苯甲基)醚(+文)，bis(2,3陽dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)ether(英文)、化合物W3-溴-4-[2，3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenedio(英文)；化学结构如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定风干的松节藻i/zocfome/aco"/ervo/tfes样品粉碎后用95%乙醇提取，提取液减压浓縮；浓縮物用蒸馏水悬浮后，用乙酸乙酯萃取，减压浓縮。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱，直至二者体积比为1:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检査，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得14个部分L,L14。Ls部分[石油醚丙酮=2:l]洗脱部分经过氧化铝柱色谱，硅胶色谱，重结晶可得纯化合物I，经波谱分析，此化合物为3,4-二溴-5-(乙氧基甲基)-l,2-二苯酚(中文)，3,4-dibromo-5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。Lu)部分[氯仿甲醇=5:l]洗脱部分经过硅胶色谱，釆用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，可得纯化合物II，经波谱分析，此化合物为4，4'-亚甲基-二(5,6-二溴-1,2-二基酚)(中文)，4,4'陽methylenebis[5,6-dibromo-1,2-benzenediol〗(英文)。L部分[氯仿甲醇=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，重结晶可得纯化合物m，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴_4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(methoxymethyl)-l,2誦benzenediol(英文)。L9部分[石油醚丙酮=1:l]洗脱部分经过硅胶色谱，S印hadexLH20凝胶色谱，HPLC纯化得化合物IV，经波谱分析，此化合物为3-溴-4,5-二羟基-苯甲醛(中文)，3-bromo画4,5-dihydroxy-benzaldehyde(英文)。Ln部分[氯仿甲醇=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，氯仿-甲醇为洗脱剂，然后分别过Bio-beads柱,HPLC纯化得化合物V，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4，5-二羟基苯蜀甲基-5-(羟甲基)-l,2-二苯酚(中文)，3-bromo隱4-[2,3隱dibromo-4，5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(hydroxymethyl)-l，2-benzenediol(英文)。L，o部分[氯仿甲醇=5:l]洗脱部分经过硅胶色谱，SephadexLH20凝胶色谱，HPLC纯化得化合物VI，经波谱分析，此化合物为二(2,3-二溴-4，5-二羟基苯甲基)醚(中文)，bis(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)ether(英文)。Lu部分[氯仿甲醇=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，氯仿-甲醇为洗脱齐IJ，然后经过HPLC纯化得化合物Vn，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚(中文)，3-bromo-4—[2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl—5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenedio(英文)。酪氨酸激酶活性抑制活性测试采用酶联免疫吸附测定法(ELISA),受体激酶为C-zb'"阳性对照药物Glivic(格列卫)。细胞的恶性转化及生长与细胞中酪氨酸激酶表达水平有关，酪氨酸激酶抑制剂能够阻断那些存在酪氨酸激酶过量表达及活性增加的肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞的增殖。大多数细胞生长因子受体含有酪氨酸激酶的肽链序列，故这类受体通称为酪氨酸激酶受体。根据肽链序列的相似性及结构特点，这些受体被分成若干家族第1类以上皮生长因子受体(EGFR)为代表，此类受体的高表达常见于上皮细胞肿瘤；第2类为胰岛素受体家族，包括胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)和胰岛素相关受体(1RR)等，在血液细胞肿瘤中常见此类受体的高表达；第3类为血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)家族，包括PDGFRa，PDGF(3，克隆刺激因子(CSF-la)，C-hY等，此类受体在脑肿瘤和血液细胞肿瘤等中常见高表达；第4类为纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族，包括有FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4和角化细胞生长因子受体等，此类受体在血管生成方面起重要作用；第5类为血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)，是血管生成的重要正性调节因子；另外，还有肝细胞生长因子受体(HGFR)类、FibroneetinIII型受体类及神经细胞生长因子受体(NGFR)家族等。C-yb'f受体作为III型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员，利用蛋白酪氨酸激酶抑制剂可抑制其激酶活性来治疗高表达C-h'f受体的多种肿瘤，通过作用C-hY受体，抑制酪氨酸受体磷酸化，抑制酪氨酸激酶异常激活，从而有效地抑制高表达C-A:"受体的多种肿瘤。本发明具有如下优点(1)、来源丰富我国是海洋大国，拥有丰富的海洋生物资源，海藻资源分布尤其广泛。(2)、疗效显著作为极具海洋特色的多卤代化合物，溴酚类药物是一种新型、高效的酪氨酸激酶抑制剂，在黑色素荷瘤鼠体内表现出显著的抗肿瘤疗效。(3)、副作用小溴酚类药物来源于海洋红藻，属纯天然生物制品，相比化学合成类药物具有高效低毒的优点。具体实施例方式实施例1溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定风干的松节藻i/wtfo附e/acow/en;o/t^样品14.4kg(干重)粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小时；合并浸提液，提取液4(TC下减压浓縮得乙醇提取物723g，浓縮物用IO倍重量蒸馏水悬浮后，用等体积乙酸乙酯萃取，减压浓縮，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比500:ll:l)，直至二者体积比为1:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱(体积比20:11:1)，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得14个部分L,L,4。Ls部分[石油醚丙酮体积比=2:l]洗脱部分经过氧化铝柱色谱，硅胶色谱[石油醚:乙酸乙酯体积比=7:1]，重结晶[石油醚:乙酸乙酯=5:1]可得纯化合物I，经波谱分析，此化合物为3,4-二溴-5-(乙氧基甲基)-l,2-二苯酚(中文)，3,4-dibromo-5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。Lu)部分[氯仿甲醇体积比=5:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，可得纯化合物II，经波谱分析，此化合物为4,4'-亚甲基曙二(5，6隱二溴隱l,2-二基酚)(中文)，4,4'-methylenebis[5,6-dibromo-1，2-benzenedioi;](英文)。L部分[氯仿甲醇体积比=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇(50:1-20:1-10:1-5:1)进行梯度洗脱，重结晶可得纯化合物m，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(methoxymethyl)-1，2-benzenediol(英文)。L9部分[石油醚丙酮体积比=1:l]洗脱部分经过硅胶色谱，SephadexLH20凝胶色谱[石油醚:氯仿:甲醇=5:5:1]，HPLC[甲醇:水:乙酸K)。/。:20。/。:0.10/。]纯化得化合物IV，经波谱分析，此化合物为3-溴-4,5-二羟基-苯甲醛(中文)，3-bromo-4,5画dihydroxy-benzaldehyde(H)。Lu部分[氯仿甲醇体积比=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，氯仿-甲醇为洗脱剂，然后分别过Bio-beads(氯仿:乙酸乙酯1:1)，HPLC纯化得化合物V，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]甲基-5-(羟甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(hydroxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。Lw部分[氯仿甲醇体积比=5:l]洗脱部分经过硅胶色谱，SephadexLH20凝胶色谱[石油醚:氯仿:甲醇巧:5:1]，HPLC纯化得化合物VI，经波谱分析，此化合物为二(2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲基)醚(中文)，bis(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)ether(英文)。L部分[氯仿甲醇体积比=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，氯仿-甲醇为洗脱剂，然后经过HPLc纯化得化合物vn，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4，5-二羟基苯基]-甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4，5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenedio(英文)。实施例2酪氨酸激酶活性抑制活性测性采用双抗体夹心ELISA法。按C-W试剂盒说明，将化合物样品稀释成一定浓度(l吗/mL)加入到96孔板中，除空白孔外，分别加入100|iL血清标本，再加入生物素化抗体工作液50|aL，混匀后于25'C孵育60min，洗板4次，分别于各孔(包括空白孔)加入辣根过氧化酶标记的亲和素100(iL，于25°C孵育30min。加底物显色液(OPD)10(^L于各孔避光室温孵育15min后，每孔加终止液(l.8N硫酸)100jaL并立即置于检测仪中测定490nm的光吸收值检测底物磷酸化。阳性对照Glivic(格列卫)，可竞争性地结合C-ito酪氨酸激酶ATP结合域，抑制酪氨酸受体磷酸化。:溴酚化合物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-zto受体的恶性肿瘤的防治。实施例3体内动物试验1、实验材料(1)瘤株B^黑色素瘤细胞，山东医学科学院药物研究所药理室提供。(2)实验动物青岛市实验动物中心提供C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重20士2g，68周龄。2、试验方法(1)小鼠B^黑色素瘤荷瘤鼠造模将培养生长旺盛的B16黑色素瘤细胞悬浊液浓度调为1X10VmL,无菌条件下于小鼠左侧背部皮下注射B16黑色素瘤细胞悬浊液0.2mL/只，整个操作过程30min内完成；24h后随机分为4组，10只/组，雌雄各半，分笼喂养。CompoundICompoundIICompoundIIICompoundWCompoundVCompoundVICompoundVII阳性对照Glivic45.6(lpg/mL)67.6(l吗/mL)80.1(l|ig/mL)53.8(l吗/mL)70.1(l吗/mL)44.4(l昭/mL)71.4(1(xg/mL)80(lOjiM/mL)有抑制作用有抑制作用有抑制作用有抑制作用有抑制作用有抑制作用有抑制作用有抑制作用(2)分组及给药受试组将溴酚化合物分别用重量浓度30。/。的二甲基亚砜(DMSO)溶解，按照150mg/Kg剂量稀释成相应的给药浓度(分别为药物l组-药物7组)；空白对照组(30%的二甲基亚砜)；阳性对照组(60mg/Kg的氮烯咪胺)。从接种第5天开始，每天一次，连续腹腔注射(i.p)给药14天，观察小鼠生长情况。末次给药24h后，颈椎脱臼处死小鼠，取瘤块称重，计算肿瘤生长的抑制率(抑瘤率)。(3)指标检测抑瘤率(％)=(空白对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重x1000/0见表2。结果显示，药物组及阳性对照组的平均瘤重均低于空白对照组，其中药物3组的瘤重和阳性对照组的瘤重与空白对照组比较差异均有显著性。表中*表示与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。表2小鼠瘤重及抑瘤率(±s，n=10)Table2WeightofTumorandInhibitionRatios(±s，n=10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.海洋溴酚化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于所述海洋溴酚类化合物分别为3，4-二溴-5-(乙氧基甲基)-1，2-二苯酚化合物I、4，4′-亚甲基-二(5，6-二溴-1，2-二基酚)化合物II、3-溴-4-[2，3-二溴-4，5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚化合物III、3-溴-4，5-二羟基-苯甲醛化合物IV、3-溴-4-[2，3-二溴-4，5-二羟基苯基]甲基-5-(羟甲基)-1，2-二苯酚化合物V、二(2，3-二溴-4，5-二羟基苯甲基)醚化合物VI、3-溴-4-[2，3-二溴-4，5-二羟基苯基]-甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚化合物VII及其药物学上可接受的盐、酯或醚。2.按照权利要求1所述海洋溴酚化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于所述制备治疗恶性肿瘤药物是指制备治疗各种高表达C-kit受体的恶性肿瘤药物。全文摘要本发明涉及治疗恶性肿瘤的药物，具体地说是7种海洋溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。本发明溴酚化合物及其盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治。文档编号A61K31/055GK101342157SQ200710015299公开日2009年1月14日申请日期2007年7月13日优先权日2007年7月13日发明者史大永,晓范,袁兆慧,凤许,韩丽君申请人:中国科学院海洋研究所