专利名称：：两种溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及治疗恶性肿瘤的药物，具体地说是两种海洋溴酚类化合物的制备方法、药理活性、用途及药学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物；该化合物及其衍生物作为蛋白质酪氨酸激酶(pTOte/"ybV7a^，PTK)抑制剂，可用于治疗各种高表达C-hY受体的恶性肿瘤。
背景技术：
：随着分子肿瘤学的发展，抗肿瘤药物的研究也从传统的细胞毒药物趋向作用于分子靶点的新型药物。蛋白酪氨酸激酶(PTK)是癌症治疗的标靶之一，原癌基因C-h'虔HZ4猫科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于4号染色体长臂上，编码145-165kDa跨膜受体(CD117)，具有酪氨酸激酶活性。它的产物是m型酪氨酸蛋白激酶生长因子受体，其结构类似于巨噬细胞集落刺激因子和血小板衍生物生长因子受体，属免疫球蛋白超家族成员，具有胞外5个免疫球蛋白样类似结构的配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区。在正常组织中，C-hY蛋白在肥大细胞、间质细胞、黑素细胞和乳腺上皮细胞表达。C-ZbY信号通路的自分泌和旁分泌刺激参与人肿瘤的发生，并在多种肿瘤中起到癌基因的作用。C-hY蛋白是生长因子和干细胞因子(SCF)受体，它和配体干细胞因子间的相互作用可激活内在的酪氨酸激酶，随之使细胞内蛋白磷酸化，导致细胞内信号传导途径的激活。原癌基因C-ybY突变会引起C-hY蛋白的胞外段或胞内段发生变化，导致C-h'f蛋白受体持续开放，各种底物蛋白不断自身磷酸化，使得调节细胞分化、增殖、凋亡、趋化和粘附等特性的传导信号级联释放并扩大，通过该途径促进了细胞生长，抑制了细胞凋亡，细胞正常生物学特性消失而发展为肿瘤细胞。C-y^的致癌潜能已经在许多实验中得到证实，Hines等发现，转染了C-;b'f的MCF-7乳腺癌细胞系在培养基中的生长及增殖速率增快，而且这种增殖可被抗C-hY抗体所阻抑；Caruana等对转染了C4/虔因的重组NIH3T3成纤维细胞进行培养，发现C-hY的活化可促进细胞增殖并且产生一个变异的表现型，这已经在细胞克隆及裸鼠肿瘤模型中得到了证实。近年来，越来越多的研究者研究关于把C-y^受体作为分子靶治疗高表达C-hY受体的肿瘤，寻找小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂，从而开发高效的新型抗癌药物。从现代药物研究开发的历史可见，每次创新药物的开发应用，首先来自某类新型天然先导化合物的发现，海洋是生命的起源地，在海洋独特的生态环境中，大多海藻能产生一些很有特色的活性物质。发明人从一种海洋红藻中得到两个结构新颖的溴酚类化合物，活性测试表明其对PTK酶有很强的抑制活性，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治，包括胃肠道间质瘤(GIST)、肥大细胞增生型白血病、生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、急性白血病、成神经细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌和乳腺癌等。
发明内容本发明目的是提供了两种溴酚类药物在制备治疗高表达C-kit受体恶性肿瘤药物中的应用，溴酚化合物及其盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为两种具有蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制活性的海洋溴酚类化合物及其药物学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治。溴酚化合物结构分别如下CHOEtBrOH3_溴_4_[3-溴-4，5-二羟基苯基1甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚3-bromo—4画[3一bromo画4，5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(ethoxymethyl)-l，2國benzenedio15R，10R-2，7-二溴-3，8-二羟基-5，10-二甲氧基-5，10-二氢-苯并吡喃并methy1—5—(ethoxymethyl)l,2-benPTPlBenediol(英文)；3-溴-4-[3-溴-4,5-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(中文)。取F,部分上硅胶柱，用石油醚-丙酮进行洗脱，并以凝胶Sephadex-LH20纯化得本发明化合物2，经波谱分析，此化合物为5R,10R—2,7-dibromo-3，8隱dihydroxy隱5,10-dimd;hoxyl-5,10-dihydro-chromeno[5,4,3-cde]chromene(英文)、5民1011-2,7-二溴-3,8-二羟基-5,10-二甲氧基-5,10-二氢-苯并吡喃并[5,4,3《(16]苯并吡喃(中文)。上述化合物具有以下理化特性化合物l蜡状固体；紫外光谱UV(MeOH)Xmax(logs)289.50(3J6),207.50(4.76)腿；红外光谱IR(KBr)vraax3388(OH),2924,2870,1662,1608,1583,1490,1427,1348,1284,1095,981,754cm-1.低分辨质谱EIMSm/z(%)450,448,446[M]+(1.5,3,1.5),404(43),402(86),400(43),387(20),385(40)，383(20)，323(52),221(52),277(18),275(18)，242(100),213(18),139(10),121(18),57(11).高分辨质谱HREIMSm/z445.9357(计算值C16H1679Br205445.9364).核磁共振iHNMR(500MHz，acetone-A)数据3.43(2H,q,7=7.2,CH2-9),1.10q(3H,t,J:7.2,CH3-10),4.32(2H,s,CH2-8),4.08(2H,s,CH2-7),6.49(1H,d，《/=2.4，CH陽6'),6.73(1H,d,/=2.4,CH-2'),6.97(lH,s，CH-6).核磁共振13CNMR(125MHz，acetone-^)数据133.1(s,C-l'),123.2(d,C-2'),109.6(s,C-3')，141.4(s,C陽4'),146.1(s,C-5'),114.7(d，C陽6'),36.1(t,C隱7),129.7(s，C-4),114.5(s,C-3),142.9(s,C-2),144.2(s,C-l),115.8(d,C-6),130.5(s,C-5),70.9(t,C-8),65.7(t,C隱9),15.1(q，C-10).化合物2无色棱晶(石油醚/丙酮3:1);mp188.5-189.5°C,UVmax(MeOH):229.0(logs4.65),289.0(4.35),318.5(3.89)nm;红外光谱IR(KBr)vmax:3491,2920,1618,1479,1419,1342,1242,1093，1018,955,928，879cm-L低分辨质谱EIMSm/z(%)462,460,458(M+,18%/36%/18%),431(50),429(100),399(37),397(74),395(37),149(8);高分辨质谱HREIMSm/z457.9003(M+)，(计算值C,6H,279Br206457.9001).核磁共振NMR(500MHz，acetone-^)数据:3.55(6H,s,OCH3),6.22(2H,s,CH-5，CH-10),7.32(2H,s,CH-1,CH-6),9.10(2H,s，OH).核磁共振13CNMR(125MHz，acetone-^)数据56.0(q,OCH3),123.6(d,C-l),109.9(s,C画2)，144.4(s,C-3),136.2(s,C-3a),99.2(d,C-5),113.8:s,C陽5a),123,6(d,C-6),109.9(s，C-7),144.4(s,C-8),136.2(s,C-8a),99.2(d,C-10),113.8(s，C隱lOa),120.4(s,C-10b),120.4(s,C-lOc).酪氨酸激酶活性抑制活性测试采用酶联免疫吸附测定法(ELISA),受体激酶为C-^，阳性对照药物Glivic(格列卫)。细胞的恶性转化及生长与细胞中酪氨酸激酶表达水平有关，酪氨酸激酶抑制剂能够阻断那些存在酪氨酸激酶过量表达及活性增加的肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞的增殖。大多数细胞生长因子受体含有酪氨酸激酶的肽链序列，故这类受体通称为酪氨酸激酶受体。根据肽链序列的相似性及结构特点，这些受体被分成若干家族第1类以上皮生长因子受体(EGFR)为代表，此类受体的高表达常见于上皮细胞肿瘤；第2类为胰岛素受体家族，包括胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)和胰岛素相关受体(IRR)等，在血液细胞肿瘤中常见此类受体的高表达；第3类为血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)家族，包括PDGFRa，PDGFp，克隆剌激因子(CSF-la)，C-h/等，此类受体在脑肿瘤和血液细胞肿瘤等中常见高表达；第4类为纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族，包括有FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4和角化细胞生长因子受体等，此类受体在血管生成方面起重要作用；第5类为血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)，是血管生成的重要正性调节因子；另夕卜，还有肝细胞生长因子受体(HGFR)类、FibroneetinIII型受体类及神经细胞生长因子受体(NGFR)家族等。C-ybY受体作为III型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员，利用蛋白酪氨酸激酶抑制剂可抑制其激酶活性来治疗高表达C-y^受体的多种肿瘤，通过作用C-hY受体，抑制酪氨酸受体磷酸化，抑制酪氨酸激酶异常激活，从而有效地抑制高表达C-h'/受体的多种肿瘤。本发明具有如下优点(1)、来源丰富我国是海洋大国，拥有丰富的海洋生物资源。(2)、疗效显著作为极具海洋特色的多卤代化合物，溴酚类药物是一种新型、高效的酪氨酸激酶抑制剂，在小鼠体内表现出显著的抗肿瘤疗效。G)、副作用小溴酚类药物来源于海洋海藻，属纯天然生物制品，相比化学合成类药物具有高效低毒的优点。具体实施例方式，施例1溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定采集并风干海洋生物多管藻(尸o/，^/2om'awrceo/ato)样品9.6kg(干重)，用10L95%乙醇提取三次，每次72小时；合并浸提液，提取液40。C下减压浓縮的乙醇提取物310g，浓縮物用IO倍重量蒸馏水悬浮后，采用等体积乙酸乙酯萃取，减压浓縮，得乙酸乙酯相浸膏100g。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比从500:1至1:1)，改用氯仿-甲醇梯度洗脱(体积比从20:1至1:1)，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得8个部分L,Ls。L4[石油醚:丙酮体积比=3:l]洗脱部分上硅胶柱，以氯仿-丙酮(体积比9:1)进行洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得3个部分F「F3。取F2部分上硅胶柱，用氯仿-甲醇(体积比15:1)进行洗脱，并以凝胶Sephadex-LH20(甲醇洗脱)纯化得本发明化合物1(52毫克)，经波谱分丰斤，lt匕{七合物为3-bromo-4-[3-bromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(ethoxymethyl)l,2-benPTPlBenediol(英文)；3-溴-4-[3-溴-4,5-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(中文)。取F,部分上硅胶柱，用石油醚-丙酮(体积比4:1)进行洗脱，并以凝胶Sephadex-LH20纯化得本发明化合物2(62毫克)，经波谱分析，此化合物为5R,10R-2,7-dibromo-3,8-dihydroxy-5，10-dimethoxyl画5,10画dihydro-chromeno[5,4,3-cde]chromene(英文)、511,1011-2,7-二溴-3,8-二羟基-5,10隱二甲氧基-5，10-二氢-苯并吡喃并[5,4，3^￡16]苯并吡喃(中文)。实施例2酪氨酸激酶活性抑制活性测性采用双抗体夹心ELISA法。按C-hY试剂盒说明，将化合物样品稀释成一定浓度(lpg/mL)加入到96孔板中，除空白孔外，分别加入100pL血清标本，再加入生物素化抗体工作液50jiL，混匀后于25。C孵育60min，洗板4次，分别于各孔(包括空白孔)加入辣根过氧化酶标记的亲和素100pL，于25°C孵育30min。加底物显色液(OPD)100pL于各孔避光室温孵育15min后，每孔加终止液(l.8N硫酸)100pL并立即置于检测仪中测定490nm的光吸收值检测底物磷酸化。阳性对照Glivic(格列卫)，可竞争性地结合C-^酪氨酸激酶ATP结合域，抑制酪氨酸受体磷酸化。表1对蛋白质酪氨酸激酶活性的抑制率(％)Figure1Inhibitionofproteintyrosinekinase<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[实验结论]:溴酚化合物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-hY受体的恶性肿瘤的防治。实施例3体内动物试验1、实验材料(1)瘤株B^黑色素瘤细胞，山东医学科学院药物研究所药理室提供。(2)实验动物青岛市实验动物中心提供C57BL/6小鼠，雌雄各半,体重20±2g，68周龄。2、试验方法(1)小鼠B,6黑色素瘤荷瘤鼠造模将培养生长旺盛的B16黑色素瘤细胞悬浊液浓度调为1X1(f/mL,无菌条件下于小鼠左侧背部皮下注射B16黑色素瘤细胞悬浊液0.2mL/只，整个操作过程30min内完成；24h后随机分为4组，10只/组，雌雄各半，分笼喂养。(2)分组及给药受试组3-溴-4-[3-溴-4,5-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-l,2-二苯酚(药物l组)、511,1011-2,7-二溴-3,8-二羟基-5,10-二甲氧基-5，10-二氢-苯并吡喃并[5,4,3-cde]苯并吡喃(药物2组)分别用重量浓度30。/。的二甲基亚砜(DMSO)溶解，按照150mg/Kg剂量稀释成相应的给药浓度；空白对照组(30%的二甲基亚砜)；阳性对照组(60mg/Kg的氮烯咪胺)。从接种第5天开始，每天一次，连续腹腔注射(i.p)给药14天，观察小鼠生长情况。末次给药24h后，颈椎脱臼处死小鼠，取瘤块称重，计算肿瘤生长的抑制率(抑瘤率)。(3)指标检测抑瘤率(％)=(空白对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重x1000/0见表2。结果显示，药物1组、2组的平均瘤重均低于空白对照组，其中药物2组的瘤重和阳性对照组的瘤重与空白对照组比较差异均有显著性。表中*表示与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1.两种溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于所述溴酚类化合物为3-溴-4-[3-溴-4，5-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚和/或5R，10R-2，7-二溴-3，8-二羟基-5，10-二甲氧基-5，10-二氢-苯并吡喃并[5，4，3-cde]苯并吡喃及其药物学上可接受的盐、酯或醚。2.按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述制备治疗恶性肿瘤药物是指制备治疗各种高表达C-hY受体的恶性肿瘤药物。全文摘要本发明涉及治疗恶性肿瘤的药物，具体地说是两种溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。本发明溴酚化合物及其盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治。文档编号A61K31/352GK101342158SQ20071001529公开日2009年1月14日申请日期2007年7月13日优先权日2007年7月13日发明者史大永,柳全文,晓范,凤许,韩丽君申请人:中国科学院海洋研究所