一种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体及其制备方法，该RNAi中间载体以表达载体PBI121为骨架，在骨架上克隆入拟南芥肌动蛋白10用来形成干扰载体颈环结构中的环状部分；同时，在拟南芥肌动蛋白10一端分别引入了XhoI、NcoI、PstI酶切位点，另一端引入SacI、ClaI酶切位点。本发明以表达载体PBI121为骨架，通过引入拟南芥肌动蛋白10和五个酶切位点构建成具有独立结构和功能特点的新载体，该载体为构建RNAi载体的中间载体，可用于基因沉默。同时，对中间载体进行了PCR鉴定，为此载体在RNAi干扰载体构建中的应用奠定了基础，该制备方法，能够简化实验步骤，节省实验时间，提高实验效率，降低实验成本。
【专利说明】—种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]RNAiCRNA干扰)技术属于基因沉默领域，能够使目的基因表达效率降低甚至消除。实验过程中，如果验证某一基因功能，需要对目的基因进行沉默，以期观察生物的表型性状是否有变化，进一步确定基因功能。传统RNAi干扰载体构建过程繁琐、费时、费力，因此还不能满足使用需求。
【发明内容】
[0003]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体，可用于基因沉默。本发明的另一目中上述用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体的制备方法，可以加快构建的速度、提高效率，省时、省力。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
一种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体，以表达载体PBI121为骨架，在骨架上克隆入拟南芥肌动蛋白10用来形成干扰载体颈环结构中的环状部分；同时，在拟南芥肌动蛋白10 一端分别引入了 Xho1、NcoI ,PstI酶切位点，另一端引入Sac1、ClaI酶切位点。
[0005]所述的中间载体含有CaMV35S启动子、NOS终止子和卡纳霉素抗性基因。
[0006]所述的中间载体含有⑶S报告基因,且⑶S报告基因与目的干扰序列共融合表达。
[0007]在拟南芥肌动蛋白10左端依次引入了 Xho1、Nco1、PstI酶切位点，右端依次引入Sac1、ClaI酶切位点。
[0008]所述的用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体的构建方法，其特征在于:先在表达载体 PBI121 为骨架上添加 HindII1、BamH1、Sail、Spe1、Pst1、Nco1、XhoI 酶切位点，然后在骨架上克隆入拟南芥肌动蛋白10。
[0009]有益效果:与现有技术相比，本发明以表达载体PBI121为骨架，通过引入拟南芥肌动蛋白10和五个酶切位点构建成具有独立结构和功能特点的新载体，该载体为构建RNAi载体的中间载体，可用于基因沉默。同时，对中间载体进行了 PCR鉴定，为此载体在RNAi干扰载体构建中的应用奠定了基础，该制备方法，能够简化实验步骤，节省实验时间，提闻实验效率，降低实验成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是RNAi中间载体的结构示意图；
图2是PBI121载体酶切位点的添加鉴定结果图；
图3是中间过渡表达载体的构建PCR鉴定结果图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0012]实施例1 RNAi中间载体
用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体，如图1所示，以表达载体PBI121 (市售)为骨架，在骨架上克隆入拟南芥肌动蛋白10(Genebank登陆号为AT5G52360.1，NM_124615)用来形成干扰载体颈环结构中的环状部分；同时，在拟南芥肌动蛋白10左端依次引入了 Xhol、Nco1、PstI酶切位点，右端依次引入Sac1、ClaI酶切位点。中间载体含有CaMV35S启动子、NOS终止子和卡纳霉素抗性基因。中间载体含有GUS报告基因，且GUS报告基因与目的干扰序列共融合表达。
实施例2 PBI121载体酶切位点的添加。
[0013](I)设计PBI121的35S启动子引物。
[0014]上游引物:5'-GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTC-3' (HindIII)；
下游引物:5 ' -CCCGGATCCGTCGACACTAGTCTGCAGCCATGGCTCGAGGTCCCCCGTGTTCTC-3 '(酶切位点为 BamH1、Sail、Spe1、Pst1、Nco1、Xhol)。
[0015](2)以PBI121质粒为模板，进行PCR扩增。
[0016]PCR体系为:1 μ L质粒DNA，上下游引物各I μ L，Taq酶0.2 μ L (5 U/μ L)，1xTaq 酶 buffer 2 μ L, 10 mM dNTP 2 μ L, ddH20 12.5 μ L，总体系为 20 μ L。
[0017]PCR 程序为:94 °C, 3 min ；94 °C，30 s ；55 °C,45 s ；72 °C, 50 s ;30 个循环，最后 72°C延伸 10 min。
[0018](3)上述(2)中的PCR产物和PBI121质粒分别经过酶切(酶切体系为=HindIII Iμ L, XhoI I μ L, I μ L 1xK Buffer, 17 μ L 质粒，总体系为 20 μ L ；37°C 孵育 3h)后进行连接反应(连接体系:10xT4 DNA Ligase Buffer 2.5 yL，PCR 产物 0.3 pmol，pBI121 载体 0.03 pmol, T4 DNA Ligase I μ L，补水至 25 μ L ; 16°C过夜反应)。
[0019](4)改造后的PBI121载体酶切鉴定:用Pstl/EcoRI双酶切(酶切体系为=HindIIII μ L, XhoI I μ L, I μ L 1xK Buffer, 17 μ L 质粒，总体系为 20 μ L ；37°C 孵育 3h)改造后的质粒，I号和3号泳道出现了预计的2200bp左右的目的条带，初步说明成功引入了酶切位点，如图2所示。
[0020](5)测序鉴定:经酶切初步鉴定为阳性的单菌落送上海生工测序，测序结果进一步表明所添加的酶切位点与测序结果一致。
[0021]实施例3中间过渡表达载体的构建。
[0022](I)扩增拟南芥肌动蛋白10的引物:
上游引物:5' -GGGCTGCAG ATGGCGAACG CGGCGTCGGG-3' (Pst I)；
下游引物:5' ~GGGGGATCCCCTAGAGAGCTCGACTTTTGATGAT~3/ (BamHI )。
[0023](2)以上述(I)为引物，拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR。
[0024]PCR体系为:1 UL拟南芥DNA，上下游引物各I μ L，Taq酶0.2 μ L (5 U/μ L)，1xTaq 酶 buffer 2 μ L，10 mM dNTP 2 μ L, ddH20 12.5 μ L，总体系为 20 μ L。
[0025]PCR 程序为:94 °C，3 min ；94 °C，30 s ；58 °C，45 s ；72 °C，50 s ;30 个循环，最后 72°C延伸 10 min。
[0026](3)引入内含子后可用酶切位点为:XhoI—NcoI — PstI — intron — SacI—Clal。
[0027](4) PCR鉴定:出现了 1300bp左右的目的带，如图3所示。
[0028]PCR体系为:1 μ L重组质粒，上下游引物各I μ L，Taq酶0.2 μ L (5 U/μ L)，1xTaq 酶 buffer 2 μ L，10 mM dNTP 2 μ L, ddH20 12.5 μ L，总体系为 20 μ L。
[0029]PCR 程序为:94 °C，3 min ；94 °C，30 s ；57 °C，45 s ；72 °C，50 s ;30 个循环，最后 72°C延伸 10 min。
[0030](5)测序鉴定:酶切鉴定为阳性的单菌落送上海生工测序，结果进一步表明添加的酶切位点及引入的拟南芥肌动蛋白序列与测序结果一致，说明中间载体构建已成功构建。
【权利要求】
1.一种用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体,其特征在于:以表达载体PBI121为骨架，在骨架上克隆入拟南芥肌动蛋白10用来形成干扰载体颈环结构中的环状部分；同时，在拟南芥肌动蛋白10 —端分别引入了 Xhol、Nco1、PstI酶切位点，另一端引入Sac1、ClaI酶切位点。
2.根据权利要求1所述的用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体，其特征在于:所述的中间载体含有CaMV35S启动子、NOS终止子和卡纳霉素抗性基因。
3.根据权利要求1所述的用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体，其特征在于:所述的中间载体含有GUS报告基因,且GUS报告基因与目的干扰序列共融合表达。
4.根据权利要求1所述的用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体，其特征在于:在拟南芥肌动蛋白10左端依次引入了 Xho1、Nco1、PstI酶切位点，右端依次引入Sac1、ClaI酶切位点。
5.权利要求1所述的用于抑制目的基因表达的RNAi中间载体的构建方法，其特征在于:先在表达载体 PBI121 为骨架上添加 HindII1、BamH1、Sail、Spe1、Pst1、Nco1、XhoI 酶切位点，然后在骨架上克隆入拟南芥肌动蛋白10。
【文档编号】C12N15/82GK104263750SQ201410505644
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】胡德龙, 颜志明, 杨宝林, 董慧, 许建民, 雷武生 申请人:江苏农林职业技术学院