Dna分子片段与载体连接的方法及在大容量抗体库构建中的应用的制作方法

专利名称：：Dna分子片段与载体连接的方法及在大容量抗体库构建中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种DNA分子片段与载体连接的方法及其在大容量抗体库构建中的应用。
背景技术：
：DNA分子连接一直是重组质粒构建过程的关键环节，由于连接效率的限制，使得一些重组克隆的获得较为困难，尤其在构建各类DNA分子库的过程中，连接效率尤为重要。因此，提高连接效率对于提高转座子数量具有重要意义，尤其是在通过基因工程手段构建包括抗体、多肽和各种其他蛋白质文库的过程中具有重要意义。近年来，利用噬菌体抗体库技术制备各种诊断和治疗性抗体已经成为目前基因工程抗体领域一个重要的技术手段，而其基础依赖于各种类型的大容量抗体库资源的存在。抗体库库容量和质量是决定是否能够获得高亲和力目标抗体的关键。近年来，国外已经利用各种优化的技术构建了一些大容量抗体库，并从中获得了许多有开发前景的抗体分子，目前已经有多株抗体进入临床实验。其中有代表性的大容量抗体库主要是AG公司的HuCALGOLD⑧库和CAT公司的CAT⑧抗体库，这两个抗体库的库容量均已经超过了101()，并且目前仍在继续扩建，利用这两个抗体库目前已经制备出多种治疗性抗体进入临床前和临床研究阶段。从技术上讲，制约大容量抗体库构建的关键因素主要是连接和转化的效率。高效的连接和转化技术是构建大容量抗体库的前提和保证。Sheet等人W从PCR条件、克隆用酶切位点的选择、载体特点等方面进行条件的优化，以提高连接的效率，并通过多次电转化使库容量达到6.7xl09。也有人对抗体基因克隆的方法进行改进，采用两步克隆甚至三步克隆法来实现大容量抗体库的构建[2]。电击转化是目前最高效的转化方式，经过多次电转化积累库容量是实现大容量的必要途径。而对于单次电击转化而言，感受态细胞的质量、连接产物的大小与质量、连接产物的浓度及电击缓冲液的组成等都是影响转化效率的重要因素。连接效率不仅决定了正确连接产物的比例，同时连接产物的质量还直接影响电击转化的效率，提高连接效率和连接产物的质量将极大提高转化的效率，减少转化的次数。普通的连接不仅效率低，而且连接产物成分复杂，其中的非正确连接的载体和片段将对电击转化效果造成干扰。以一个普通的双酶切连接为例，连接体系最终的连接产物包括以下几种形式载体二聚体和多聚体、片段二聚体和多聚体、载体和片段线性连接体及正确的载体与片段环状重组载体。因此，普通连接产物不论是正确连接产物的比例还是在成分的复杂程度上都很难达到高效电击转化的要求。也有研究通过首先构建初级库进而对其通过重组技术进行扩建的例子，利用这种方法构建抗体库可以绕过大量电击转化的瓶颈，通过不同抗体分子间轻重链重组的方法实现抗体多样性的增加，例如，Sblatten)W等人利用Cre-loxp重组的方法构建了库容量达1011以上的大容量抗体库。然而，由于这种方法所构建的抗体库仅仅是通过轻重链互换的方法扩大库容量，而在CDR区的多样性上存在不足，因此具有一定的缺陷。
发明内容本发明的目的是提供一种高效的DNA分子片段与载体连接的方法及其在大容量抗体库构建中的应用。连接和转化是构建包括抗体和多肽在内的各种大容量蛋白质文库的过程中一个限制性的技术。最终所获得的库容量的大小直接取决于通过转化所获得的转座子的数目。而其中连接产物的质量和正确连接产物的数量是影响转化效率进而影响库容量的关键。高效连接影响5因素涉及载体的性质、限制性内切酶的酶切与回复连接的效率、载体与目的基因的比例、连接体系的浓度等因素。从DNA分子角度上讲，双酶切连接过程实际上可以分解为两个过程，首先是DNA分子两片段之间的单酶切位点连接，形成线性连接产物，这一过程可认为是分子间连接，其次是线性连接产物的分子内连接，即线性连接产物的自身环化过程。而分子间和分子内连接的最佳的实验条件不同，对于分子间连接而言，一方面需要增加分子间碰撞的机会，另一方面需要降低同片段间自连的比例；对于分子内连接而言，则需要降低分子间碰撞接触的机会，同时增加分子内自连接的比例。普通双酶切连接无论如何优化条件都无法将两个过程分开实现每一步的连接条件的最优化处理，因此连接效率一般很低，最高只有百分之十几。因此，设计将两步连接过程分开进行，可实现每一步连接的最优化处理，从而可以提高总体连接效率。故而，本发明的技术方案提供一种DNA分子片段与载体连接的方法，载体上包括至少三个不同的酶切位点El、E2和E3，其中E2位于El和E3之间；待连接的DNA分子片段至少包括酶切位点El和E3,先对载体上酶切位点El和E2进行酶切和去磷酸化；再对DNA分子片段的酶切位点El进行第一步酶切和连接，得到DNA分子片段和载体的线性连接产物，然后回收正确大小的连接产物；最后对连接产物的酶切位点E3进行第二步酶切和连接，得到自连接的环状连接产物。由于第一步连接产物经过了胶回收处理，去除了非正确连接体的干扰，因此在第二步回复连接的产物中没有其他杂分子的干扰，更利于之后的电击转化。E2位点的作用在于减少由第一步酶切后载体分子间发生连接的比例，即通过首先对载体用El和E2进行酶切和去磷酸化处理，可以减少载体分子间的反向连接，从而降低载体的自连。本发明的方法，其中所述酶切位点E1、E2和E3可选自载体上已有的常用的限制性内切酶的酶切位点，如Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、BsaI、BseYI、DraIII或EarI等中的任意一种。其中优选酶切效率和恢复连接能力强的限制性内切酶。也可以通过引入的方式将需要的包含有酶切位点的序列插入至已知序列的载体中，对载体进行一定程度的改造，以获得更易操作、效果更好的连接载体。本发明的方法，其中所述酶切位点E3更优选为Sfil、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI等酶切位点，因为其具有非反向回文结构，而大部分限制性内切酶为反向回文结构，如BamHI(AGGCCT)，这类酶切位点在连接时没有方向性，因此更容易形成相同分子间的连接，从而导致正确连接比例降低，而SfiI等一类具有非反向回文结构的内切酶则对连接有方向性要求，更容易形成正确连接。本发明El最优选NotI酶切位点，E2最优选EcoRI酶切位点，和E3最优选SfiI酶切位点。本发明的方法，其中第一步连接体系中的DNA浓度控制在30-40ng/pL,第二步连接的DNA浓度控制在1.5-2.5ng/|aL。本发明的方法，为弥补第二步酶切和连接所导致的产物量的损失，在第一步连接之后还可以包括通过PCR的方法对连接产物进行一定量的扩增，以保证后期连接产物的产量。为了减少PCR扩增可能导致的克隆偏向性和基因突变，我们选择了保真度高的DNA聚合酶，如UltrapfU，同时将PCR的循环数控制在15个循环以内，以确保抗体库的基因多样性和正确性。本发明的方法，为了去除连接缓冲液对电击转化的影响，还包括对最后得到的连接产物进行超滤处理实现产物的浓缩和缓冲体系交换，将连接产物浓度提高到100ng/nL以上并最终溶于电击缓冲液中。本发明利用两步连接的方法实现了单链抗体基因同载体之间的高效连接，与普通的双酶切连接相比，连接效率从原来的白分之十几提高到30%以上。同时，由于最终的连接体系中去除了大量非正确连接的小分子和其他组分，使电击转化的效率得到提高。本发明利用两步连接的方法构建了大容量全合成人源性噬菌体抗体库，该抗体库由12个子库组成，总库容量达1.35xl01、上述技术方案具有如下优点该方法能够实现DNA分子片段与载体之间有效的连接，降低了非正确连接的不同形式聚合体的产生，使正确连接产物的比例在连接体系中占到30°/。以上，并且连接产物中成分简单，无小分子片段，对电击转化的干扰成分较少，有利于实现高效的电击转化。经一步纯化后，连接产物电击转化的产出克隆达到同等量质粒的30%~50%,进一步说明连接产物的比例试验数据可靠。该方法在抗体库、肽库和其他蛋白及cDNA文库的构建中能够实现目的基因和载体间的高效和高质量连接，连接产物适合构建各种大容量蛋白质文库。图l是本发明实施例噬菌体展示载体PHB-pIX-EcoRl质粒示意图2是本发明实施例CDR3区Klenow酶反应产物2%琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DNA分子量Marker;15:Klenow酶反应产物；图3是本发明实施例抗体轻链/重链基因拼接过程示意图4是本发明实施例抗体基因轻重链拼接及扩增产物1%琼脂糖电泳图，其中1:轻链基因扩增产物；2:轻链基因拼接产物；3:重链基因拼接产物；4:重链基因扩增产物；M:D2000DNAMarker;图5是本发明实施例单链抗体基因拼接及扩增产物1%琼脂糖电泳图，其中1、3:拼接产物；2、4:扩增产物；M:D2000DNAMarker;图6是本发明实施例单链抗体与载体第一步连接产物1%琼脂糖凝胶电泳图，其中1:连接前片段；2:连接前载体；3、4:连接后产物；M:XDNA/EcoRI+HindIIIMarkers;图7是本发明实施例单链抗体与载体连接产物的PCR扩增产物1%琼脂糖电泳图，其中1:UltrapfU扩增单链抗体与载体的连接产物；2:LA-taq扩增单链抗体与载体的连接产物；3:pfb扩增单链抗体与载体的连接产物；4:入DNA/EcoRI+Hind111Markers;图8是本发明实施例不同连接条件下连接产物1%琼脂糖凝胶电泳图，其中l:连接产物(lng4iL);2:连接产物(2ng4iL);3:连接产物(3ng4iL);4:连接产物(4ng/jiL);5:连接产物(5ng/jaL);6:普通连接产物；7:连接前片段；M:XDNA/EcoRI+HindlllMarkers;图9是本发明实施例菌落PCR鉴定PHB-pIX-scFv抗体库基因插入率PCR产物1%琼脂糖电泳图，其中lane1~lane10,lane11lane20:PCRproductsofscFvgene;M:XDNA/EcoRI+HindlllMarkers。具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明以大容量全合成噬菌体单链抗体库的构建为具体实例，目的在于提供一种高效的两步酶切和连接的方法，该方法可用于构建多种大容量抗体库和其他蛋白质文库。1、本发明所用的连接载体PHB-pIX-EcoR的构建PHB-pIX展示载体(如图l)是在实验室保存的基于噬菌体外壳蛋白pIX蛋白展示载体PHB1HCSFV的基础上改造而成，该载体来源于噬菌体展示载体pAK600。首先从辅助噬菌体M13K07中调取pIX蛋白编码基因(99bp)，利用酶切位点NotI和HindIII克隆入PHB1HCSFV中，替换pIII蛋白基因；其次，在展示蛋白pIX编码基因下游约80bp处利用酶切位点HindIII和BamHI插入39bp的Cre-Loxp重组位点Loxp-wt，以便用于抗体库的Cre-loxP重组；另外，为减小质粒的大小，以更便于进行电击转化，将原质粒Lac启动子上游的约lOOObp的Lacl基因敲除，该基因具有抑制下游scFv抗9体基因渗漏表达的作用，我们利用菌株TG1本身的Lacl基因及培养基中添加Lac启动子抑制剂葡萄糖的方法代替载体上Lacl基因的作用。最后，在scFv基因克隆位点SfiI和NotI之间插入一段41bp的序列，代替原载体中的一段无关的scFv序列，序列中在SfiI下游26bp中含有一个EcoRI酶切位点。改造后的载体为2800bp,可以实现不同单链抗体间的轻重链重组，同时由于酶切位点EcoRI的引入，更方便于利用两步连接的方法实现单链抗体的克隆及之后的高效的电击转化。2、抗体基因库的制备2.1框架基因的选择与合成本研究根据KnappikW等人的报道，逸捧Vk1、Vk3、V人l和VX3胚系基因家族为轻链框架序列，VH3、Vh4和VH5胚系基因家族基因为重链框架序列。设计了7条通用序列作为抗体框架，按照大肠杆菌密码子使用规律将框架的氨基酸序列转换为DNA序列，并人工合成该7条框架基因的DNA序列，将其克隆入pGEM-T载体中。合成重链框架基因时，分别在其上游引入轻重链间的Linker(63bp)，同时在轻链的上游引入酶切位点Sfil以便将抗体基因克隆入展示载体PHB-pIX。Vk1、Vk3、V人l和V人3基因序列见序列表SEQIDNo.14所示；VH3、Vh4和VH5基因序列见序列表SEQIDNo.57所示。2丄1CDR3的设计与合成本研究参考文献和已知抗体序列，通过对轻重链CDR3氨基酸序列，尤其是关键位置的序列进行分析，使关键部位的氨基酸按设计比例引入，共设计合成33条半随机引物，每条引物长约6070bp。将合成的引物利用下游小引物通过Klenow反应将其延伸为双链，将33条引物按多样性比例分组混合，每组总量为100pmo1。在50jliL体系中加入lOOpmol的CDR3引物，120pmo1下游反向小引物，体系于94°C热变性5min后缓慢降至37°C,立即加入5|iL10xKlenowreactionBuffer,20UKlenowFragments,2|aLdNTP(10mM),并用无菌蒸馏水将体积补足至50pL。37。C反应30min，QiagenMini-EluteKit回收反应产物(见图2)，稀释100倍，紫外分光光度计进行定量。2.2轻重链基因库的构建分别将双链CDR3与相应的框架基因进行拼接，以获得完整轻重链基因，具体方法如图3所示。将克隆有轻重链框架基因的pGEM-T载体分别对其基因上游的SphI位点进行酶切，回收线性化载体，紫外分光光度计定量。将不同CDR3双链按理论多样性比例混合，然后同相应线性化质粒以一定比例混合，进行拼接延伸PCR反应。具体是在30|iL体系中加入3pL10xPfuBuffer,2pLdNTP(10mM),2.5UPfiiDNA聚合酶和相应的反应底物，先进行15cycles的拼接反应，之后将30pL体系分为3份作为模板，分别加入下游小引物KFR4、LFR4和HFR4，进行10个循环的PCR反应，胶回收PCR产物，分别获得完整轻链和完整重链基因见图4,其中重链的5'端含有25bp的轻链FR4区3，端序列和完整的轻重链Linker(63bp)编码序列，可以实现轻重链间的拼接。2.3单链抗体基因库的制备将轻重链基因以摩尔比为1:1的比例进行重叠延伸PCR反应。首先经过15个循环的拼接反应使轻链基因与重链基因拼接为完整的单链抗体基因，再以此产物为模板，用5'端引物PSL(为位于SfiI上游无关序列)和3'端引物3H3R进行扩增反应，得到完整的单链抗体基因，见图5。同时通过引物3H3R添加酶切位点Notl，预期片段长度约为780bp。PSL5,-CAAACGATCACCACGACTGACTCGAC-3,,，如SEQIDNo.8所示；3H3R:5，-AGAGACATGCGGCCGCGCTCGACACGGTCACCAG-3,,如SEQIDNo.9所示。3、两步连接中的第一步连接一基因片段与载体通过NotI连接将载体PHB-EcoR用EcoRI和NotI酶切，回收线性化质粒，并进行常规去磷酸化反应。将scFv基因库用Notl酶切处理，两者以摩尔比1:11丄5比例进行连接。体系浓度为30-40ng/pL,16。C连接3~4h。琼脂糖电泳回收3700bp大小的连接产物PHB-pIX-scFv，如图6所示。4、单链抗体与载体连接产物的PCR扩增由于下一步的酶切和连接会损失部分的样品，为弥补样品的损失，在获得连接产物PHB-pIX-scFv后，利用PCR的方法对其进行补偿，以获得更多的连接产物。该环节在各种基因集和蛋白质库的构建中对保障库的多样性非常重要。同时，为了避免不必要的重复扩增及克隆，PCR过程中尽量减少PCR的循环数，并优化引物序列，釆用高保真且适合长片段PCR的DNA聚合酶，如Ultrapfli,LATaq等。设计并合成PCR引物ccPCR:5，-GTAAGTCGCTGGTTGCAGTGTTGTGC-3',如SEQIDNo.lO所示；和PSL:5，-CAAACGATCACCACGACTGACTCGAC-3，，同SEQIDNo.8所示；其中ccPCR与载体PHB-EcoR上Sfil位点与EcoRI位点间序列互补，PSL为抗体基因5，端Sfil位点前序列。利用引物PSL与ccPCR，以连接产物PHB-scFv为模板按如下体系进行PCR反应。PCR条件为94。C30s，70°C30s，72°C5min,15cycles之后胶回收PCR产物。对几种高保真DNA聚合酶的比较结果如图7所示。利用PCR回收试剂盒对PCR产物进行纯化并定量。成分加入量pIX-scFv50ng10xPCRBuffer續P4|nLPSLandccPCR0单x2UltrapfoDNA聚合酶H20补足至40nL125、环状连接产物的制备在积累了充足的PCR产物后，要对其进行自身环化连接，获得环状连接产物。而在该环节，要尽量减少载体聚合体的形成，主要是通过降低体系中连接产物的浓度以降低其载体碰撞的机会从而降低分子间连接的几率，提高分子内连接的几率。我们对SfiI酶切后的产物进行回复连接，对连接体系中产物浓度与连接效率的关系进行了比较，结果如图8所示。可以看到，与普通的两步连接相比，连接产物的成分简单、正确连接产物的比例可以达到30%以上，体系中没有小分子片段的干扰，这一点对后期的高效转化非常重要。并进行回复连接反应，体系中DNA浓度为1.5-3ngL。16°C连接过夜。于65°C作用30min将连接体系中的T4DNA连接酶灭活。分别用去酶柱处理以除去连接酶，用超滤柱处理以进行纯化及浓缩(具体见Millpore使用说明书)。6、电转化感受态的制备及电击转化制备大容量抗体库挑取生长良好的TG1单菌落于SOB培养基中(无Mg2+),37°C培养过夜。次曰1%转接于200rnL新鲜制备SOB培养基中(无Mg2+)。培养至OD6(K)nm=0.450.5时，4000rpm,4。C,10min离心收菌。冰冷无菌蒸馏水洗涤2次，冰冷10%超纯甘油洗涤2次。重悬于2mL预冷电击缓冲液中。将纯化后的连接产物与200luL感受态混合，冰上作用2-5min，转到预冷的电击杯中。进行电击转化，参数为25|^F，2.5KF,200Q，电击后迅速用23mLSOC培养液将菌悬起，37。C，150rpm培养lh。取部分进行适当稀释涂板，计数克隆数，计算库容量。剩余部分扩大体积至400mL,继续37°C,200rpm培养至OD6Q0nm=0.8,离心收菌，重悬于15mL冻存液中，分装于-70。C保存备用。通过多次电击转化，对不同框架抗体库进行积累，总库容量达到1.35xl(T(下表l),对抗体库中克隆进行菌落PCR扩增，抗体基因插入率达到100%(见图9)。随机挑选100个克隆进行测序，抗体基因插入正确，且未发现重复克隆，表明抗体库多样性良好。表l:抗体库各框架子库及库容量统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由以上实施例可以看出，本发明具体涉及通过对DNA分子连接过程的详细分析，将普通双酶切和连接过程拆分为两个单酶切连接过程分别进行，并对每个过程的条件进行最优化处理，包括酶切位点的选择、酶切位点保护碱基的数目、连接体系中各成分的浓度和比例等。同时釆用引入第三无关中间酶切位点的方法以减少载体聚合体的形成，采用优化的PCR方法弥补连接回收过程中产物的损失。两步连接中第一步连接效率可到达50°/。以上，第二步连接效率达到30%以上，第二步连接过程中产物损失由一二步之间的PCR过程弥补。为保证连接产物多样性和减少PCR导致的偏向性，对PCR过程进行优化和控制，以确保产物的产量和不必要的重复扩增。包括引物优化、高效高保真DNA聚合酶的选择、循环数的控制等几个方面。最终连接产物成分简单、无小分子干扰，正确连接产物比例占30%以上。该两步连接法可用于各种高效克隆的需要，用于通过基因工程手段构建包括抗体、多肽和各种其他蛋白质集合及其他生物分子集合，具有广泛的通用性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。参考文献1.SheetMD，AmersdorferP，FinnemR,da/.Efficientconstructionoflargemon-immunephageantibodylibrary:theproductionofhighaffinityhumansingle-chainantibodiestoproteinantigens.ProcNatlAcadSciUSA.1998,95:6157-622.dehaardHJ,vanneerN，ReursA，fl/.Alargemom-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies.JBioChi.1999，274:18218-2304.KnappikA,GeLM，HoneggerA,etal.Fullysynthetichumancombinatorialantibodylibraries(HuCAL)basedonmodularconsensusframeworksandCDRsrandomizedwithtrinucleotides.JMolBiol.2000,296:57-86序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所〈120〉DNA分子片段与载体连接的方法及在大容量抗体库构建中的应用<130〉KHP09112892.2<160>10〈170>Patentlnversion3.5<210>1<211〉320<212〉DNA<213>人工序列<400>1ca^ELCgettc3ccacgactgactcgacctagaactcatggcccagccggccatggccgata60tccagatgaccc3gagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggtgatcgcgtg3ccatta120cctgccgcgcgagcc鄉gcattagcagctatctggcgtggteitcagcag犯accgggta180犯gcgccg犯actgttaatttatgcggccagcagcttgcagagcggcgtgccgtcgcgtt240ttagcggctcgggttcgggcaccgattttaccctgaccatctcgagcttgcagccggagg300acttcgccacctactattgc320<210〉2<211〉342<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉2c肌acga/tcaccacgactgactcgacctag肌ctcatggcccagccggcc3tggCCggCC60cagccggccatggccgatatcgttctgactcaatctccggc犯ctctgtctctgtctccg120ggtg認gtgcaactctgtcttgtcgtgca"tctcagtctgtgagctctagttatctggca180tggtatcagcEi犯a6iccgggtcaggcaccgcgtctgctgatttatggtgcaagctctcgt240gc咖tggtgttccggcacgttttagtggtagtggtagcggcaccgattttactctgact300atctcgagtctgg肌ccggaggacttcgccgtgtactattgc342<210〉316<211〉323<212>諷<213>人工序列<400〉3caaacgatcaccacgactgactcgacctag犯ctcatggcccagccggccatggccgsta60tcgttctgactcaacctccgtctgtttctggtgcaccgggtcaacgtgttactattagct120gctctggcagctct3gcaatattggtagtaactatgttagctggtatcagcaactgccgg180gtactgcaccgaaactgctgatttatgataataaccagcgcccctcaggtgttccggatc240gttttagtggcagcaaaagcggt3CC3gCgctagtctggcaattactggtctgc犯agcg300gg3Ct3tt3Ctgc323〈210〉4<211〉317<212〉諷<213〉人工序列〈400〉4caaacgatcaccacgactgactcgacctagaactcatggcccagccggccatggccagct60acgaactgacccagccgccg鄉gtgtcggtggcgccgggtcagaccgcgcgtatcacct120gctcgggcgatgcgctgggcgata肌tacgcgagctggtatcagcagaaaccgggtc娜180caccggtgctggtgatttacg犯gattctaaacgcccgtctggcatcccgggiacgcttta240gcggctcgaattcgggcaacaccgcgaccctgaccattagCggC3CCC3g300鄉cggactattactgc317<210>5〈211〉357<212〉DNA<213〉人工序列<400〉5柳ggcggctcgaccataacgtatactatacgaagttatcgagctcgggc603gCg鄉tgC組tggtgga,cggtggcggtctggtgc鄉cgggtggcagcctgcgt120ctgagctgcgC3gCg3gCggcttcacctttagcagctacgcgatgagctgggtgcgcc服180gcaccgggtaaaggtctggaatgggtgagcgCg3tt6lgCggtagcggcggcagcacctac240ta_tgcggata_gcgtgaaaggccgttttaccatctcgcgtgataactcgaaaaacaccctg300tacctgcag3tgaacagcctgcgtgcggaagataccgcggtgtattattgcgcacgt357<210>6〈211〉354〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉6鄉ggcggctcgaccataacttcgtat犯tcgaagttatcg站ctcgggc603gCC郷tgC33Ctgcagg3朋gCggtCC3ggcctggtgaaaccctgagc120ctgacctgtaccgtgtctggcggtagcattetgctcttatt180ccacctg'gcaa鄉tctggaatggatcggttacatctattacagcggcag240aatccaagcctgaagagccgcgtgaccatc3gcgtcg3taccagc肌gaaCC3gttCSLgC300ctgaagctgagctctgtgaccgcagccgataccgcggtgtattattgcgc3Cgt354<210〉7<211〉357<212>函A〈213〉人工序列<400〉7卿ggcggctcgacca/taacttcgtataatgtatactatacgaagttatcgagctcgggc60agcgaagttcaactggttcaaagcggtgccaaxxaggcgaaagcctgaaa120attagctgcaaaggctctggttattcttttacctcttattggatcggctgggttcgccag180atgccaggt3aaggtctggaatggatgggtattatttatccgatacccgc240tattctccaagctttc郷gtcaggttactattagcgcagataaaagcatcagcaccgcc300tatctgcagtggagctctctgaaagccagcgateiccgccatgtattattgcgcacgc357<210>8〈211〉26<212>腿〈213>人工序列<400>8caaacgatcaccacgactgactcgac26<210>9<211>34〈212〉丽<213>人工序列<400>9agagacatgcggccgcgctcgacacggtcaccag34<210〉10<211>26<212>DNA<213>人工序列〈400>10gtaagtcgctggttgcagtgttgtgc2权利要求1、一种DNA分子片段与载体连接的方法，其特征在于，载体上包括至少三个不同的酶切位点E1、E2和E3，其中E2位于E1和E3之间；待连接的DNA分子片段至少包括酶切位点E1和E3，先对载体上酶切位点E1和E2进行酶切和去磷酸化；再对DNA分子片段的酶切位点E1进行第一步酶切和连接，得到DNA分子片段和载体的线性连接产物，然后回收正确大小的连接产物；最后对连接产物的酶切位点E3进行第二步酶切和连接，得到自连接的环状连接产物。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点El选自Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI酶切位点中的一种。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E2选自Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI酶切位点中的一种。4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E3选自Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI酶切位点中的一种。5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切位点E3为具有非反向回文结构的限制性内切酶位点，选自SfiI、AlwNI、BsaI、BseYI、DraIII或EarI中的一种。6、如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，第一步连接体系中DNA的浓度控制在30-40ng/|iL，第二步连接的DNA浓度控制在1.5-2.5ng/pL。7、如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，在所述第一步连接之后还包括通过PCR的方法对连接产物进行一定量的扩增。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR釆用保真度高的DNA聚合酶，同时将PCR的循环数控制在15个循环以内。9、如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对最后得到的连接产物进行浓缩和缓冲体系交换，将连接产物浓度提高到100ng/]iL以上并最终溶于电击缓冲液中。10、权利要求l-9任一项所述的方法在构建抗体库、肽库和其他蛋白及cDNA文库中的应用。全文摘要本发明公开了一种DNA分子片段与载体连接的方法，载体上包括至少三个不同的酶切位点E1、E2和E3，其中E2位于E1和E3之间；待连接的DNA分子片段至少包括酶切位点E1和E3，先对载体上酶切位点E1和E2进行酶切和去磷酸化；再对DNA分子片段的酶切位点E1进行第一步酶切和连接，得到DNA分子片段和载体的线性连接产物，然后回收正确大小的连接产物；最后对连接产物的酶切位点E3进行第二步酶切和连接，得到自连接的环状连接产物。本发明能够实现DNA分子片段与载体之间有效的连接，降低了非正确连接的不同形式聚合体的产生，使正确连接产物的比例在连接体系中占到30％以上，有利于实现高效的电击转化。文档编号C12N15/66GK101619323SQ20091009126公开日2010年1月6日申请日期2009年8月14日优先权日2009年8月14日发明者余云舟,俞炜源,孙志伟,杜威世,双王申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所