一种将多个dna片段同时连接至同一载体上的方法
【专利摘要】一种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法，是依托Glass?milk的DNA胶回收方法，将几个待连接的DNA片段PCR产物以及载体片段从凝胶上一同洗脱并回收，然后加入DNA连接酶与连接缓冲液，4℃连接过夜，将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖。本方法的连接过程无需考虑DNA片段浓度匹配问题，操作简单，周期短，价格低廉。
【专利说明】—种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种一步将几个DNA片段连接至同一个载体上的方法。
【背景技术】
[0002]DNA片段的重组是一种基因工程中重要的实验技术，目的基因与质粒相连构建重组分子，实现目的基因的体外操作，如目标蛋白的体外表达、定点突变、DNA测序等。重组工程一般都要求较高的重组效率、重组准确性以及更大的目的片段连接长度。这一技术的进步将有利于质粒构建、基因重组等生物基因操作，有利于推动生物研究的发展。
[0003]DNA分子的连接就是在一定条件下，经DNA连接酶的催化，两个双链DNA片段在5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键，然后两个DNA分子得以相连。目前使用得最多的是T4-DNA连接酶，T4连接酶的反应需要ATP参与催化完成。
[0004]在实际操作过程中，DNA的连接也需要考虑DNA片段的结构，需要考虑载体和片段末端的匹配性，目前DNA连接主要分为黏性末端和平末端连接两大类。
[0005]黏性末端的连接：用同一种限制性内切酶或两种限制性内切酶分别处理载体和外源DNA片段使得两者皆获得统一的黏性末端，在连接反应中通过连接酶的催化，二者能够通过黏性末端连接。但是，在连接过程中，外源片段以及质粒载体都可能发生自身环化，几个分子之间可能会串联形成寡聚DNA分子，而且连接也可能出现反方向连接。为了避免此类情况，现在的技术中都将外源DNA和载体DNA的分子比控制在3倍到10倍之间，或将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酶去掉以防止自身环化。一般情况下质粒DNA上带有多个不同的酶切位点，而外源DNA片段也能找到与之匹配的酶切位点，如果是PCR产物，则在扩增该片段时，将一段酶切位点设计在引物中以便与载体相连。
[0006]平末端的连接：由产生平末端的限制性内切酶或者核酸外切酶消化产生。相比于黏性末端的连接，平末端不受黏性末端的限制，但连接难度也有所提高，效率要比黏性末端低。因此，在实际操作过程中，需要的载体和外源DNA浓度均要相应提高，通常还需要加入一定量的聚乙二醇促进DNA分子的聚合从而提高效率。
[0007]综合以上两种主流DNA连接方法，黏性末端与平末端的连接都难以克服DNA片段自身相连、自连以及顺序问题、形成寡聚物问题，前者虽然连接效率高，但受到自身条件限制；后者虽自由度高，但连接效率低(仅为黏性末端连接效率的1%)。
[0008]另一方面，I个以上的外源DNA片段与载体的连接通常涉及到更多步骤。以3个外源DNA片段的载体构建为例，外源片段制备好后，从凝胶上分别回收，然后再进行连接。但是该方法存在诸多弊端，第一、几个DNA片段分别胶回收，操作繁琐，耗时长；第二、几个DNA片段无论来源是否相同，起始浓度是否相同，分别胶回收的回收率都可能不尽相同，并且产量都较低，此时会给连接造成困难；第三、根据回收效率的高低，需要根据分子量大小的不同，对不同外源DNA片段及载体片段最终的浓度进行调整，使最终几个片段正确连接，避免错连、自连。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术中分开回收目的片段时回收率偏低的问题，提供一种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法，使DNA的连接低成本、高效率、便捷操作。
[0010]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法，该方法步骤如下：
[0011]a、首先根据载体和待连接DNA片段末端情况选择合适的限制性内切酶，再依该些待连接DNA片段来源的DNA基因组分别设计该些待连接DNA片段的引物，该些引物具有与前述限制性内切酶相应的酶切位点；
[0012]b、以该些引物分别对该些待连接片段进行PCR扩增得到目的片段，沉淀DNA，用前述限制性内切酶分别消化载体和PCR扩增产物，将消化产物进行电泳检测；
[0013]上述PCR扩增反应体系为：模板DNAl uL,20u mol/L的上游引物I. 25 u L、20 u mol/L 的下游引物 I. 25 u LUOXpfu buffer 10 u L、2. 5mmol 的 dNTP8 u L, pfu SI I u L及ddH20补齐至50ii L。
[0014]PCR 反应程序为 94°C预变性 5min, 94°C变性 lmin,55°C退火 lmin,68°C延伸 Imin,共进行35个循环。
[0015]如果是从生物体基因组或基因文库上直接获得的目的片段，需要构建含目的片段的载体，再进行筛选、酶切最终得到目的片段。
[0016]C、切下含有目的片段与载体的胶块置于同一离心管中，用标准Glass milk法回收DNA ；
[0017]d、以5XDNA连接缓冲液2 U L、DNA连接酶I y I及上述载体与目的片段回收产物组成10 ii L的DNA连接反应体系，不足10 ii L时以ddH20补齐，4°C连接过夜。
[0018]本方法在目的片段胶回收的过程中，将所有回收目的片段包括载体的凝胶放置在同一管中进行DNA回收，以确保高回收率，然后再进行DNA片段的连接及转化，可一次性将多个外源DNA连接至载体上。外源DNA与载体DNA进行的预处理过程与普通DNA连接方法类似，而本发明方法无需考虑外源DNA与载体DNA的浓度问题，且能够一次性连接多个片段，连接长度大，操作简单。实验证明，利用此方法构建载体具有以下优点：
[0019]I、增大DNA总量，回收成功率高：本方法基于各个目的片段DNA混合回收时，增大DNA的总量，使得DNA分子绑定率增加，从而增加回收率低以提高连接效率。且Glass milk法不受体积的限制，在回收时根据凝胶的体积加入对应量的Glass milk悬浮，Glass milk分子的表面积大，DNA量越多，能够结合的DNA就越多。但使用时，需多次反复洗涤。
[0020]2、无需考虑目的片段DNA浓度：本发明方法在胶回收时，将多个带有相应酶切位点的目的片段与线性载体在同一管内一起回收，从而省去了测浓度、调配比等步骤。
[0021]3、操作耗时短、适用范围广：本方法一次性将所有目的片段进行胶回收，能够节省大量的试剂、时间及精力等，仅转化一次，无需构建中间载体，使载体的构建相对简便。正确率一般在90%以上，整个流程从拿到目的片段后可在24小时内完成。
【专利附图】
【附图说明】[0022]图I是本发明A片段、B片段的PCR扩增结果。
[0023]其中，M ：DNA Marker ；A1和A2 ：A片段；B1和B2 ：B片段；数字表示重复。
[0024]图2是本发明各目的片段包括截体片段的酶切结果图。
[0025]其中：M:DNA Marker，A指A片段，B指B片段，G指GFP片段，SK指载体片段，箭头所示为各目的片段。
[0026]图3是本发明四个目的片段连接后的阳性克隆检测。
[0027]其中：M ：DNA Marker :阴性对照，即无模板对照；+ :阳性对照，即含有四个片段的质粒DNA的PCR检测；1-8 :菌落PCR结果，示1、3、4、5、7泳道的阳性结果。
[0028]图4是重组质粒的HindIII与BamHI双酶切结果图。
[0029]其中：M ：DNA Marker ;双酶切结果显示两条亮带，即连接成功的A、B、GFP片段以及原载体片段。
【具体实施方式】
[0030]本实施例的载体构建以棉铃虫单包埋核型多角体病毒（Heliocoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)上的Ha-fp-A片段（见SEQ ID NO. I所示)和Ha-fp-B片段(见SEQ ID NO. 2所示)(以下简称A、B段，A片段大小为637bp，B片段大小为531bp,)及绿色突光蛋白（Green fluorescent protein, GFP)基因（为包含pBlueGFP载体的蛋白基因，大小为714bp)与载体pBluescript SK为例。
[0031]本实施例中的限制性内切酶Hindlll、EcoRV, XhoI, BamHI以及DNA连接酶购自TianGen 公司；Glass milkk 购自 Biostar 公司。
[0032]具体步骤如下：
[0033]引物设计：在HaSNPV上的目标基因两端分别设计A、B的引物(华大基因)，引物碱基序列如表1。
[0034]表1引物序列
[0035]
【权利要求】
1.一种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法，其特征在于，该方法步骤如下： a、首先根据载体和待连接DNA片段末端情况选择合适的限制性内切酶，再依该些待连接DNA片段来源的DNA基因组分别设计该些待连接DNA片段的引物，该些引物具有与前述限制性内切酶相应的酶切位点； b、以该些引物分别对该些待连接片段进行PCR扩增得到目的片段，沉淀DNA，用前述限制性内切酶分别消化载体和PCR扩增产物，将消化产物进行电泳检测； C、切下含有目的片段与载体的胶块置于同一离心管中，用标准Glass milk法回收DNA ； d、以5XDNA连接缓冲液2 μ L、DNA连接酶I μ I及上述载体与目的片段回收产物组成IOyL的DNA连接反应体系，不足10 μ L时用ddH20补足，4°C连接过夜。
2.如权利要求1所述的一种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法，其特征在于，所述步骤b中的PCR扩增反应体系为：模板DNAlyL，20ymol/L的上游引物1.25yL、20 μ mol/L 的下游引物 I. 25 μ LUOXpfu buffer 10 μ L、2. 5mmol 的 dNTP8 μ L、pfu 酶 I μ L及ddH20补齐至50 μ L。
3.如权利要求1所述的一种将多个DNA片段同时连接至同一载体上的方法，其特征在于，所述步骤b中的PCR反应程序为94°C预变性5min，94°C变性Imin，55°C退火Imin，68 °C延伸Imin,共进行35个循环。
【文档编号】C12N15/66GK103484492SQ201310460159
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】黄国华, 李顺姬, 刘双清, 王星, 成小文 申请人:湖南农业大学