用于检测猴痘病毒的nasba试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测猴痘病毒的NASBA试剂盒及其应用。本发明所提供的NASBA试剂盒中含有用于检测猴痘病毒的组合物，所述组合物由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。利用本发明所提供的NASBA试剂盒对猴痘病毒进行检测，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。本发明可快速筛查猴痘病毒，对口岸输入性疾病筛查具有重要意义，为防御疾病的传入做好技术支撑和战略储备，满足当前卫生检疫的需求。
【专利说明】用于检测猴痘病毒的NASBA试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于检测猴痘病毒的NASBA试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]猴痘病毒是一种双链DNA病毒,与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、头痛、淋巴结肿大、咳嗽和全身极度疼痛，俗称“猴天花”，为未输入我国的危险病毒之一，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液传播。
[0003]猴痘病毒于1958年首次在丹麦哥本哈根的实验室来自非洲的猴子中发现，1970年刚果报道了世界上首例猴痘人间病例，此后尼日利亚、喀麦隆等非洲国家相继有此病例报道。1978年天花消灭后，WHO制定了天花消灭后的监测规划，将猴痘作为一种重要疾病列入其中。随后WHO专家在非洲猴痘流行区进行调查，在猴子体内检出了猴痘病毒，并检测到猴痘病毒抗体，证明猴子为猴痘病毒的宿主；同时在啮齿类动物的调查中发现，一只松鼠有皮肤破溃样症状，并分离出了猴痘病毒，因此松鼠也是猴痘病毒的中间宿主。2003年美国威斯康辛州爆发了一次猴痘疫情，造成了 82人感染，其传染源是一只非洲进口的宠物土拨鼠，此次疫情感染的猴痘病毒属于毒力较弱的西非株，因此未造成人员死亡。 目前共发现两种病毒株，另外一种刚果盆地株毒性较强，几乎是致命的。从猴痘在人间流行情况来看，猴痘的致病力和传染性均比天花要弱，但是猴痘易感多种不同的动物，分布范围广，易造成流行，且一旦病毒在人体内发生重组变异，出现毒力类似天花或者超过天花的毒株，后果将不堪设想。因此研究猴痘病毒的检测技术具有重要的意义。
[0004]NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification)即核酸序列依赖性扩增技术，主要用来扩增RNA，是由一对特异性的引物介导的、连续均一的、体外核酸序列等温扩增反应过程。反应在41°C进行，在3种酶的协同作用下可在2h内将模板RNA扩增约109_12倍，且不需特殊仪器。该技术具有操作简便，特异性强，敏感性高，快速，高通量等优点，目前已经广泛应用于人类与动物的多种病毒性疾病的检测，具有良好的应用前景。在禽流感，新城疫，猪传染性胃肠炎，口蹄疫等疾病的检测中均表现出了很高的敏感性和特异性。
[0005]NASBA扩增反应技术是由一对特异性的引物引导的等温条件下的核苷酸序列的体外扩增，该反应由三种酶控制完成:禽源成髓细胞瘤逆转录酶(AMV逆转录酶)、RNA酶H和T7RNA聚合酶。反应体系除了以上三种酶外还包括:核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、一对特殊引物及各种缓冲液等。引物Pl长约45个碱基，其3'末端大约20个碱基对与模板的3'末端互补，5'末端含有能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列；引物P2大约20个碱基长，其序列与模板的5,末端一致。
[0006]整个反应分为两相:在非循环相，引物Pl与模板RNA结合，在AMV逆转录酶作用下形成RNA =DNA杂交链，随后RNaseH水解掉RNA =DNA杂交链上的RNA链，只留下一条单链DNA。然后引物P2与这条DNA链的Y末端退火，在AMV逆转录酶催化作用下合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区域，催化DNA转录为RNA，在此由每一分子DNA模板可产生100拷贝的RNA。新合成的RNA进人循环相，在循环相将成为反转录的模板，首先与引物P2结合，由AMV逆转录酶作用下催化合成一条DNA链，形成RNA:DNA杂交分子，RNaseH随后水解掉RNA，留下一条单链DNA，引物Pl退火，逆转录酶再催化合成一条新的含有T7RNA聚合酶启动子的DNA片段，T7RNA聚合酶再以此DNA为模板合成更多拷贝的RNA，如此循环反复，使RNA拷贝数被不断放大。该技术非常适合于单链RNA的扩增。
[0007]分子信标技术(NASBA-Beacon)是将NASBA技术和实时分子灯塔技术相结合,具有更加方便、快捷、敏感、不易被污染等优点。分子灯塔是具有“发夹”样结构的单链寡核苷酸探针，一般为含20~30个核苷酸，其中环状序列是与目标链互补的探针。当无靶序列存在时，茎部的2条核苷酸链互补，末端分别与荧光素(5'端)和淬火物质(3'端)结合，茎部的双链互补结构使末端的荧光素和淬火物质紧靠在一起，因荧光素共振能量转移作用而使荧光被吸收，这样荧光素就不能发光，此时便检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，随着环状序列打开，茎部的双链结构也打开，荧光素共振能量转移作用不能得到发挥，荧光素和淬火物质分离使得此时能够检测到荧光。荧光检测技术与NASBA技术都是在低温条件下反应，所以这两项技术可以完美的结合。该检测方法操作简单且省时，可以自动化操作，减少了携带污染，适合于分析高通量样本 。
【发明内容】
[0008]本发明的一个目的是提供一种用于检测猴痘病毒的组合物。
[0009]本发明所提供的用于检测猴痘病毒的组合物，由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
[0010]其中，序列I共由51个核苷酸组成，第1-31位为可被T7RNA聚合酶识别的启动子序列，第32-51位为与猴痘病毒全基因组(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138的第48332-48780位，序列4)的3’端互补的特异性序列。序列2共由26个核苷酸组成，为与猴痘病毒全基因组(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138的第48332-48780位，序列4)的5’端一致的特异性序列。
[0011]用于检测猴痘病毒的所述引物对或所述探针也属于本发明的保护范围。
[0012]在本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团 TAMRA。
[0013]在所述组合物中，组成所述引物对的两条单链DNA分子，以及所述探针的摩尔比为2:2:1 ;在所述引物对中，组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比为1:1。
[0014]本发明的再一个目的是提供一种用于检测猴痘病毒的NASBA试剂盒。
[0015]本发明所提供的用于检测猴痘病毒的NASBA试剂盒，可为如下(a)或(b):
[0016](a)含有所述组合物，以及如下物质:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、核糖核酸酶H ；
[0017](b)含有所述引物对，以及如下物质:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、核糖核酸酶H。
[0018]在本发明的一个实施例中，所述NASBA试剂盒中含有反应液I和酶混合液II ；
[0019]所述反应液I的溶剂为水，溶质及浓度如下:NTP0.5mmol/L, dNTP0.02mmol/L,Tris-HC150mmol/L,氯化镁 12.5mmol/L, 二硫苏糖醇 10mmol/L,氯化钾 87.5mmol/L,组成所述引物对的两条单链DNA分子各0.5 μ mol/L ；
[0020]所述酶混合液II的溶剂为水(如双蒸水)，溶质及浓度如下:T7RNA聚合酶8U/ μ L，AMV逆转录酶1.6U/ μ L，核糖核酸酶H0.04U/ μ L，RNA酶抑制剂1.2U/ μ L，牛血清白蛋白
0.5 μ g/ μ L,所述探针 I μ mol/L。
[0021]进一步，所述NASBA试剂盒中还可含有作为阳性对照的pGSI_MPV质粒。
[0022]所述pGS1-MPV质粒是在pGSI质粒的多克隆位点SmaI酶切位点处正向插入序列表中序列4后得到的重组质粒。
[0023] 其中，序列4为猴痘病毒全基因组(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138 的第 48332-48780 位)。
[0024]所述组合物或所述引物对或所述探针或所述NASBA试剂盒在检测或辅助检测猴痘病毒中的非诊断目的应用也属于本发明的保护范围。
[0025]在所述应用中，按照如下步骤进行反应:先将所述反应液I和所述待测样品混合，95°C放置10分钟，然后迅速将反应体系降温至0-4°C，再向反应体系中加入所述酶混合液II，41°C放置90分钟；在反应过程中，所述反应液1、所述酶混合液II和所述待测样品的配比为 20 μ L:5 μ L:1 μ L。
[0026]在所述应用中，所述待测样品来自离体的组织或器官。在本发明的一个实施例中，所述待测样品为双链DNA样品。
[0027]在所述应用中，利用所述组合物或所述引物对或所述探针或所述NASBA试剂盒对所述待测样品进行反应后，可按照如下(I)或(II)的方法确定所述待测样品中是否含有猴
痘病毒:
[0028](I)根据反应所得RNA扩增产物的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有猴痘病毒:若所述RNA扩增产物中含有大小为269nt的RNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有猴痘病毒；若所述RNA扩增产物中不含有大小为269nt的RNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有猴痘病毒。
[0029](II)利用所述组合物或所述引物对或所述探针或所述NASBA试剂盒对所述待测样品进行反应后，在紫外下观察含有所述待测样品的反应液的颜色，若含有所述待测样品的反应液产生绿色突光，则所述待测样品中含有或候选含有猴痘病毒；若含有所述待测样品的反应液不产生绿色荧光，则所述待测样品中不含有或候选不含有猴痘病毒。
[0030]进一步，以上(I)中，所述大小为269nt的RNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
[0031]在所述应用的反应过程中，若所述待测样品中含有猴痘病毒的基因组双链DNAjP么，在95°C时双链DNA将发生变性解链，冰浴降温(0-4°C)后在所述反应液I中的所述引物对(序列I和序列2)，以及所述酶混合液II中的所述AMV逆转录酶和所述T7RNA聚合酶的作用下，反转录生成RNA ;接着以反转录所生成的RNA为模板进行NASBA扩增，从而得到所述RNA扩增产物。
[0032]利用本发明所提供的NASBA试剂盒对猴痘病毒进行检测，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。本发明所设计的引物及探针只针对猴痘病毒及其亚种，而不会把其他痘病毒或其他物种扩增出来，纯度高，易保存。引物与整个genbank数据库进行BLAST检索，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法的建立，对样本的检测只需1.5小时左右即可完成，可快速筛查猴痘病毒，对口岸输入性疾病筛查具有重要意义，为防御疾病的传入做好技术支撑和战略储备，满足当前卫生检疫的需求。【专利附图】
【附图说明】[0033]图1为反应液I中镁离子浓度的优化实验结果。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道2为氯化镁1.5μL ;泳道3为氯化镁1.75μL ;泳道4为氯化镁2.0μL ;泳道5为氯化镁2.25μL ;泳道6为氯化镁2.5μL ;泳道7为氯化镁2:75μL ;泳道8为阴性对照。[0034]图2为反应液I中钾离子浓度优化实验结果。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道2为氯化钾3.75μL ;泳道3为氯化钾3.5μL ;泳道4为氯化钾3.25μL ;泳道5为氯化钾3.0μL ;泳道6为氯化钾2.75μL ;泳道7为氯化钾2.5μL ;泳道8为阴性对照。[0035]图3为不同的温度下扩增的电泳结果。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ；泳道2为42°C ;泳道3为41°C ;泳道4为40°C ;泳道5为39°C ;泳道6为38°C ;泳道7为370C ;泳道8为阴性对照。[0036]图4为检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的特异性检测结果(琼脂糖凝胶电泳)。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道2为阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)；泳道3为鸡痘疫苗；泳道4为牛痘疫苗；泳道5为羊痘疫苗；泳道6为水痘疫苗；泳道7为阴性对照。[0037]图5为检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的特异性检测结果(紫外观察)。其中，I为阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒);2为鸡痘疫苗；3为牛痘疫苗；4为羊痘疫苗；5为水痘疫苗；6为阴性对照。[0038]图6为检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的灵敏度检测结果。其中，泳道I为DNA分子量标准DL2000 ;泳道2为2.76X IO7拷贝数阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)；泳道3为2.76X IO6拷贝数阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)；泳道4为2.76X IO5拷贝数阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)；泳道5为2.76X IO4拷贝数阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)；泳道6为2.76 X IO3拷贝数阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒);泳道7为2.76 X IO2拷贝数阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)；泳道8为阴性对照。[0039]图7为猴痘病毒的NASBA试剂盒用于检测临床样本的结果。其中，泳道I为DNA分子量标准DL2000 ;泳道2为阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)，泳道3_15为临床发热病人样本抽提的DNA，泳道16为阴性对照。【具体实施方式】[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0042]羊痘疫苗、鸡痘疫苗、牛痘疫苗:购自杭州吉创生物科技有限公司；[0043]水痘疫苗:购自长春祈健生物制品有限公司。[0044]pGSI质粒:购自北京中美泰和生物技术有限公司。[0045]T7RNA聚合酶(公司名称:Thermo Fisher目录号:EP0112)、AMV逆转录酶(公司名称=Promega目录号:M5108)、核糖核酸酶H (RNase H)(公司名称:2150A目录号:2150A)、RNA酶抑制剂:(公司名称=Thermo Fisher目录号:E00382)。
[0046]实施例1、检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的制备及反应体系的建立
[0047]一、检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的制备
[0048]1、引物和探针的设计
[0049]根据猴痘病毒全基因组(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138的第48332-48780位，序列4)，设计一组引物及探针，分别是正向引物P1、反向引物P2及探针，引物及探针基因序列如下:
[0050]引物Pl (序列I):
[0051 ] 5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCAGCATCACCTATAGATGAC-3，
[0052]引物P2 (序列 2):5’ -TACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTT-3’
[0053]探针(序列3 ): 5 ’ -CATCGGAACGACGAACCACCAGAGGATGACGATG-3，
[0054]其中，引物Pl (序列I)的第32-51位为与猴痘病毒保守序列的3’端(序列4的第396-415位)互补的特异性序列，第1-31位为可被T7RNA聚合酶识别的启动子序列。引物P2 (序列2)为与猴痘病毒保守序列的5’端(序列4的第147-172位)一致的特异性序列。探针(序列3)中两处下划线部分序列反向互补，中间无下划线部分序列为序列4的第346-369位的反向互补序列， 可与NASBA扩增产物互补。
[0055]其中，探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0056]2、反应液I和酶混合液11
[0057]利用步骤I设计的引物对和探针配制反应液I和酶混合液II，同时制备阳性对照质粒，从而得到用于检测猴痘病毒的NASBA试剂盒。
[0058]反应液I 组成如下:2.5mmol/L NTP4 μ L，0.2mmol/L dNTP2 μ L, 400mmol/LTris-HC12.5 μ L, IOOmmoI/L 氯化镁 2.5 μ L，IOOmmoI/L DTT (二硫苏糖醇)2 μ L, 500mmol/L氯化钾3.5 μ L，10 μ M正反向引物各I μ L，双蒸水补充至20 μ L。各物质的溶剂均为双蒸水。
[0059]酶混合液II组成如下:20U/y L T7RNA聚合酶2.0 μ L，5U/μ L AMV逆转录酶1.6μ L，20U/y L 核糖核酸酶 H (RNase H) 0.01 μ L,40U/y L RiboLock RNase Inhibitor(RNA 酶抑制剂)0.15 μ L，10 μ g/μ L 牛血清白蛋白(BSA)0.25 μ L，5 μ mol/L 探针 I μ L。各物质的溶剂均为双蒸水。
[0060]阳性对照质粒:pGS1-MPV。pGS1-MPV是在pGSI质粒的多克隆位点SmaI酶切位点处正向插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0061]二、检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的使用
[0062]操作方法:将反应液I混匀，取20 μ I加入PCR管中，加入待测样品I μ I，放入PCR仪，95°C放置10分钟，迅速放入冰浴中放置5分钟，向其中加入5 μ I的酶混合液II，混匀，41°C放置PCR仪中90分钟，反应结束。反应过程中，最好同时设置阴性对照和阳性对照。其中，阴性对照为用蒸馏水替代待测样品；阳性对照为用阳性对照质粒(浓度为lOng/μ I的pGS1-MPV质粒)替代待测样品。
[0063]工作原理如下:由于猴痘病毒为双链DNA病毒，故采用95°C放置10分钟使猴痘病毒的基因组双链DNA变性解链，随后立即冰浴5分钟降温，在引物对(序列I和序列2)，以及AMV逆转录酶、和T7RNA聚合酶的作用下，反转录生成RNA ;接着以反转录所生成的RNA为模板进行NASBA扩增，至反应结束获得大量的RNA扩增产物。
[0064]检测结果判定方法为如下(I)或(II):
[0065](I)将RNA扩增产物进行琼脂糖凝胶，根据电泳条带的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有猴痘病毒:若得到大小为269nt的目的条带(序列5)，则所述待测样品中含有或候选含有猴痘病毒；若没有得到大小为269nt的目的条带(序列5)，则所述待测样品中不含有或候选不含有猴痘病毒。
[0066](II)反应结束后，在紫外灯下观察含有所述待测样品的反应液的颜色，若含有所述待测样品的反应液产生绿色荧光，则所述待测样品中含有或候选含有猴痘病毒；若含有所述待测样品的反应液不产生绿色荧光，则所述待测样品中不含有或候选不含有猴痘病毒。
[0067]三、反应体系及反应程序的优化
[0068]以上步骤一中反应液I的配方，以及步骤二中反应条件均是经过优化的，优化实验具体如下:
[0069]1、反应液I中镁离子浓度的优化
[0070]将步骤一 2中反应液I中的100mmol/L的氯化镁的体积设置如下平行:
1.5/1.75/2.0/2.25/2.5/2.75 μ L，其余成分不变，配合使用步骤一 2中的所述酶混合液
II，按照步骤二中所述的操作方法 进行测定，并按照步骤二中的检测结果判定方法(I)进行结果判定。以阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)作为待测样品，从而判定扩增效果。
[0071]RNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，从图中可以看出，当反应液I中的lOOmmol/L的氯化镁的体积取2.5 μ L时目的条带(269nt)最亮，扩增效率为最高。将目的条带切下后送样测序，结果证实目的条带的序列正如序列表中序列5所示。
[0072]2、反应液I中钾离子浓度优化
[0073]将步骤一 2中反应液I中的500mmol/L氯化钾的体积设置如下平行:
2.5/2.75/3.0/3.25/3.5/3.75 μ L，其余成分不变，配合使用步骤一 2中的所述酶混合液II，按照步骤二中所述的操作方法进行测定，并按照步骤二中的检测结果判定方法(I)进行结果判定。以阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)作为待测样品，从而判定扩增效果。
[0074]RNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，从图中可以看出，当反应液I中的500mmol/L氯化钾的体积取3.5 μ L时目的条带(269nt)最亮，扩增效率为最高。将目的条带切下后送样测序，结果证实目的条带的序列正如序列表中序列5所示。
[0075]3、反应条件的优化
[0076]使用步骤一 2中的所述反应液I和所述酶混合液II，按照步骤二中所述的操作方法进行测定，将其中加入酶混合液II后放置PCR仪中90分钟的温度设置如下平行:370C /380C /390C /40°C /41°C /42°C，按照步骤二中的检测结果判定方法(I)进行结果判定。以阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)作为待测样品，从而比较不同温度对检测反应的影响。
[0077]RNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果结果如图3所示，从图中可以看出，当反应温度为41 °C时目的条带(269nt)最亮，扩增效率为最高。将目的条带切下后送样测序，结果证实目的条带的序列正如序列表中序列5所示。可见，41°C为最佳的反应扩增温度。
[0078]实施例2、检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的特异性检测[0079]待测样品:阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)、羊痘疫苗、鸡痘疫苗、牛痘疫苗、水痘疫苗。其中，以上各痘类病毒疫苗利用DNA抽提试剂盒根据说明书提取基因组DNA，备用。
[0080]使用实施例1步骤一 2中的所述反应液I和所述酶混合液11，按照实施例1步骤二中所述的操作方法进行测定，按照实施例1步骤二中的检测结果判定方法(I)和(II)分别进行结果判定，从而检测NASBA试剂盒的特异性。实验同时设置以灭菌双蒸水作为待测样品的阴性对照。
[0081]RNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，从图中可以看出，只有阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)扩增出目的条带(269nt)，而其他病毒疫苗均未扩增出条带。观察紫外灯下各样品反应液的颜色，结果如图5所示，从图中可以看出，只有阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)的反应液可见明显的绿色荧光，而其他病毒疫苗均未见，与琼脂糖凝胶电泳结果一致。可见，实施例1制备的检测猴痘病毒的NASBA试剂盒具有很好的特异性。
[0082]实施例3、检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的灵敏度检测
[0083]将阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)作为待测样品，检测实施例1制备的NASBA试剂盒的灵敏度。实验同时设置以灭菌双蒸水作为待测样品的阴性对照。具体操作如下:
[0084]取已知浓度的阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒质粒)，10倍倍比稀释为如下系列浓度:2.76,2.76X 10\2.76X 102、2.76Χ 103、2.76Χ 104、2.76Χ 105、2.76Χ 106、2.76X 1O7 拷贝数/UL。以所得系列浓度的阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)分别作为模板，使用实施例1步骤一 2中的所述反应液I和所述酶混合液II，按照实施例1步骤二中所述的操作方法进行测定，按照实施例1步骤二中的检测结果判定方法(I)进行结果判定，从而检测实施例1制备的NASBA试剂盒的灵敏度。
[0085]RNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，从图中可以看出，阳性对照质粒(pGS1-MPV质粒)的拷贝数为2.76X 103以上时，均可扩增出目的条带(269nt)。观察紫外灯下各样品反应液的颜色，可见，实施例1制备的检测猴痘病毒的NASBA试剂盒具有较高的灵敏度。
[0086]实施例4、检测猴痘病毒的NASBA试剂盒的实际应用
[0087]待测样品:机场口岸入境的发热病人的离体血清，14人份。利用DNA抽提试剂盒根据说明书提取DNA，备用。
[0088]使用实施例1步骤一 2中的所述反应液I和所述酶混合液II，按照实施例1步骤二中所述的操作方法进行测定，按照实施例1步骤二中的检测结果判定方法(I)和(II)分别进行结果判定。
[0089]结果显示:14例发热病人的离体血清样本的反应液在紫外灯下均没有绿色荧光产生，且RNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测也均没有出现特异性目的条带(269nt)，从而判定14份待测样品的猴痘病毒检测结果均为阴性，见图7。
【权利要求】
1.用于检测猴痘病毒的组合物，其特征在于:所述组合物由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
2.用于检测猴痘病毒的引物对或探针，其特征在于:所述引物对由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求1所述的组合物，或权利要求2所述的引物对或探针，其特征在于:所述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求1-3中任一所述的组合物或引物对，其特征在于:所述组合物中，组成所述引物对的两条单链DNA分子，以及所述探针的摩尔比为2:2:1 ; 组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比为1:1。
5.用于检测猴痘病毒的试剂盒，为如下(a)或(b): (a)含有权利要求1或3所述的组合物，以及如下物质:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、核糖核酸酶H ； (b)含有权利要求2或3所述的引物对，以及如下物质:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、核糖核酸酶H。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有反应液I和酶混合液II ; 所述反应液I的溶剂为水.，溶质及浓度如下:NTP0.5mmol/L, dNTP0.02mmol/L,Tris-HC150mmol/L,氯化镁 12.5mmol/L, 二硫苏糖醇 10mmol/L,氯化钾 87.5mmol/L,组成权利要求1-4任一中所述引物对的两条单链DNA分子各0.5 μ mol/L ； 所述酶混合液II的溶剂为水，溶质及浓度如下:T7RNA聚合酶8U/ μ L，AMV逆转录酶1.6U/ μ L，核糖核酸酶H0.04U/ μ L，RNA酶抑制剂1.2U/ μ L，牛血清白蛋白0.5 μ g/ μ L，权利要求1-4任一中所述探针I μ mol/L。
7.权利要求1-6中任一所述的组合物或引物对或探针或试剂盒在检测或辅助检测猴痘病毒中的非诊断目的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述应用中，先将所述反应液I和所述待测样品混合，95°C放置10分钟，将反应体系降温至0-4°C，再向反应体系中加入所述酶混合液II，41°C放置90分钟；在反应过程中，所述反应液1、所述酶混合液II和所述待测样品的配比为 20 yL:5 μ L:lyL。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:所述待测样品为DNA样品。
【文档编号】C12Q1/70GK103468830SQ201310460128
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】吕沁风, 郑伟, 吴忠华, 罗鹏, 徐琦, 何蕾, 李 禾 申请人:浙江国际旅行卫生保健中心