专利名称：一种多表位疟疾疫苗及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗及其编码基因，特别是涉及一种疟疾疫苗及其编码基因。
疟原虫生活史复杂，历经了4个不同的时期首先是感染的按蚊在叮咬时将疟原虫子孢子注入血液，然后在几分钟内子孢子迅速到达肝脏侵入肝细胞，接着在1-2周的时间，疟原虫在宿主细胞内大量繁殖，导致感染的肝细胞破裂，释放出成千上万的裂殖子，再次侵入红细胞，一部分形成雌雄配子体，进入有性期。从疟原虫的生活周期可以看到，一旦到了裂殖子再次侵入红细胞的阶段，就很难通过疫苗和药物的手段对红细胞内的裂殖子进行杀伤，所以目前人们对疟疾疫苗的设计主要集中在针对疟疾感染的红细胞前期和红细胞内期的抗原，从而构建了红细胞前期疫苗(MHC)、红细胞内期疫苗、抗传播疫苗、多价杂合疟疾疫苗。
疟疾疫苗的研制和运用可为疟疾的综合治理提供有利的武器，对疟疾疫苗的研究已经近50年，最早是采用疟原虫死疫苗或射线减毒的疟原虫活疫苗，这种疫苗能够保护人类免受疟疾的侵袭，但用它来预防每年200到500万的新感染人群显然是不可行的。近年来，随着分子生物学及分子免疫学的迅速发展，已通过基因重组或人工合成多肽的方法获得大量不同种属疟原虫的不同期的特异性抗原，在针对约氏疟原虫产生具有保护性的抗体及细胞免疫反应方面也取得了巨大的进展。红细胞前期疫苗候选抗原主要是疟原虫的环子孢子蛋白CSP的运用，恶性疟原虫CSP的重复区外含有B细胞表位，这些B细胞表位可以直接激活B细胞，从而防止肝细胞感染或防止原虫在肝内发育。因为一只感染蚊的唾液腺常含有几千个子孢子，而每个子孢子能感染一个肝细胞，所以该类疫苗可以有效降低疟疾发病率，但保护力却不能得到完全保证的，因为只要有一个子孢子进入肝细胞，它即可以繁殖进入红内期。红细胞内期疫苗的候选抗原有许多，主要包括有裂殖子主要表面抗原MSA1、MSA2及环状体感染红细胞表面抗原RESA，MSA1含有至少2个B细胞表位及3个T细胞表位，所以抗MSA1抗体可以抑制裂殖子侵入红细胞，从而降低原虫密度。这几个抗原都含有B细胞及T细胞激活表位，提示它们本身具有克服MHC限制的能力，可能成为理想的疫苗候选抗原。以这三种血液期保护性抗原的免疫活性部分构建的Spf66杂合多价疫苗，是第一个抗恶性疟原虫的化学合成疫苗，1988年由patarroyo率先合成，此杂合疫苗的45肽由恶性疟原虫子孢子表面抗原重复序列NANP及血液期三个抗原的活性部分pfs35.1、pfs55.1、pfs83.1组成，抗45肽的抗体可以抑制体外活子孢子入侵肝细胞、体外裂殖子入侵RBC、蚊体中卵囊的发育，提示该疫苗对恶性疟的各期都可能有效。恶性疟Spf66自诞生起，已经过无数次的动物实验及不同疟疾流行地区人群接种实验，主要临床结果不完全一致，大多数临床实验结果令人鼓舞，证实了Spf66使用安全、有免疫原性，且对恶性疟原虫及间日疟原虫的攻击都有较好的保护作用，但保护率差异较大，所以对它的有效性还存在争议。抗传播疫苗采用的为疟原虫配子体期表达的特异蛋白pfs48/45，此蛋白诱生的特异性抗体能阻止配子受精及合子的发育，所以该类疫苗虽无直接的保护作用，但有降低及阻断传播的作用，其缺陷之一是某些抗体可能反而引起传播增强。疟疾核酸疫苗的研究最早是在1994年由Hoffman等用含约氏疟原虫CSP基因的真核表达载体，肌肉注射小鼠后，产生了抗环子孢子蛋白的特异性抗体和CTL反应，两种反应的水平均高于减毒子孢子的免疫，用5×105子孢子攻击感染后的肝期原虫负荷下降86％，已接受2-3次免疫接种的小鼠，再以102子孢子攻击，结果显示对子孢子攻击小鼠有68％被保护，说明核酸疫苗接种可用于抗疟疾感染。疟疾DNA疫苗的首次临床试验从1997年开始，采用了疟原虫环子孢子蛋白，结果显示这种单一的DNA疫苗能被较好地耐受、安全且具有免疫原性，但这种疫苗只能对单一阶段的疟原虫起作用，预防范围受到较大限制。
本发明的疟疾疫苗，其活性成分为序列1编码的蛋白质。
所述疫苗中还可以含有医用佐剂，例如福氏佐剂。
带有序列1的质粒，带有序列1的生物细胞，特别是带有序列1的真核细胞，尤其是带有序列1的大肠杆菌均属于本发明的保护范围。
SPf66是恶性疟原虫红外期的T细胞表位，CSTE即CSP(368-397)，是恶性疟原虫红内期的B细胞表位，含有广谱的Th细胞表位CST3(378-397)及Tc细胞表位CSP(368-390)，NKNDD是发现于我国海南的一株恶性疟的B细胞表位，CTB是霍乱毒素B亚基，无毒性，能与多种HLA-B，HLA-C分子结合，具有很强的免疫原性，能刺激产生粘膜IgA和血清IgG抗体，且是理想的载体蛋白和佐剂，能加强抗原表位的抗原性。本发明创造性地将SPf66、CSTE及NKNDD有机结合，又巧妙地选用CTB作为核酸疫苗的佐剂，以解决疟疾抗原性弱的问题。将各表位分别进行基因合成，组合后融合在CTB基因的3’端，构成融合基因CTB/SPf66/NKNDD/CSTE，以此融合基因构建了疟疾亚单位疫苗和DNA疫苗，实验证明，本发明的疫苗对疟原虫的攻击具有明显的保护作用，对于疟疾预防将有巨大意义。
本发明的疫苗具有多阶段、多价激发多种免疫反应的特性，免疫了这种多价疫苗的接种者被感染的按蚊叮咬后，入侵的疟原虫将被不同时期抗原产生的多重免疫杀伤和灭活，从而显著降低感染，减轻病症并阻断传播。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例2、本发明疫苗对感染疟原虫的小鼠的保护性以200只小鼠为模型，分为实验组和对照组，实验组以本发明的疫苗免疫，免疫后诱导了较高水平的体液免疫和细胞免疫。以超量疟原虫分别攻击实验组和对照组的小鼠，结果实验组的小鼠免疫保护率达70％，对照组的保护率小于5％，说明用本发明疫苗免疫的小鼠对疟原虫具有免疫性。
实施例3、本发明疫苗对感染疟原虫的恒河猴的保护性以10只恒河猴为模型，5只为实验组，5只为对照组，实验组以本发明的疫苗免疫，免疫后诱导了较高水平的体液免疫和细胞免疫。以超量猴疟原虫攻击实验组和对照组的恒河猴，结果5只免疫组的动物全部没有感染，保护率为100％，而对照组的5只恒河猴全部感染，且感染持续30天以上。说明用本发明的疫苗可以有效地对付疟原虫。
序列表<160>2<170><210>1<211>676<212>DNA<213>artificial sequence<214>人工序列<220><223><400>1acacctcaaa atattactga tttgtgtgca gaataccaca acacacaaat acatacgcta60aatgataaga tattttcgta tacagaatct ctagctggaa aaagagagat ggctatcatt 120acttttaaga atggtgcaac ttttcaagta gaagtaccag gtagtcaaca tatagattca 180caaaaaaaag cgattgaaag gatgaaggat accctgagga ttgcatatct tactgaagct 240aaagtcgaaa agttatgtgt atggaataaa acgcctcatg cgattgccgc aattagtatg 300gcaaatgaat tctaacgcta accctggtga tgaactggaa acccagaacg tgtacgcagc 360cccgaatgcg aatccgtaca gcctgttcca gaaagagaaa atggtgctgc cgaacgccaa 420cccgccggcg aacaagaaga acgcgggtcc caacaagaac gatgataaca agaacgatga 480taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagaac gatgataaca agaacgatga 540taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagggg aaacctaaag acgaattaga 600ttatgaagat attgaaaaga agatcgctaa gatggaaaag gctagcagtg ttttcaacgt 660tgtggtacca tgataa 67权利要求
1.序列1的DNA。
2.带有序列1的质粒。
3.带有序列1的生物细胞。
4.根据权利要求3所述的生物细胞，其特征在于所述生物细胞为真核细胞。
5.根据权利要求4所述的生物细胞，其特征在于所述生物细胞为大肠杆菌。
6.一种多表位疟疾疫苗，它的活性成分为序列1编码的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的多表位疟疾疫苗，其特征在于所述疫苗中还含有医用佐剂。
8.根据权利要求7所述的多表位疟疾疫苗，其特征在于所述医用佐剂为福氏佐剂。
全文摘要
本发明为一种多表位疟疾疫苗及其编码基因。本发明的目的是提供一种多阶段、多价激发多种免疫反应的多表位疟疾疫苗。本发明的疟疾疫苗，它的活性成分为序列1编码的蛋白质，疫苗内还可以含有医用佐剂，特别是福氏佐剂。本发明的疫苗对疟原虫的攻击具有明显的保护作用，对于疟疾预防将有巨大意义。
文档编号C07H21/00GK1417329SQ0113139
公开日2003年5月14日 申请日期2001年10月31日 优先权日2001年10月31日
发明者马清钧, 钟辉, 曹诚 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所