间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白、其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白，是具有糖基化磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚定及表皮生长因子样（epidermal?growth?factor-like，EGF-like）结构域的蛋白（其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示）。此外，本发明还公开了上述重组抗原蛋白的制备方法，包括间日疟原虫PvMSP1基因序列的扩增、重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。实验证明，本发明的PvMSP1重组抗原蛋白对间日疟原虫感染病人血清抗体的检测具有敏感性高和特异性强等优点，在间日疟血清流行病学调查方面具有广泛的应用前景。
【专利说明】间日疟原虫PvMSPI重组抗原蛋白、其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种用于检测间日疟感染病人血清抗体的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白；此外,本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。 【背景技术】
[0002]疟疾是严重危害人类健康、影响社会经济发展的重要寄生虫病。全球每年有约100万人死于痕原虫感染。痕疾(间日痕为主)也是我国重要传染病之一，尽管目前痕疾发病率已控制在较低水平，但是在全球气候变暖、经济发展全球化带来的人流物流增加等自然和社会因素的影响下，我国疟疾疫情尚不稳定。例如中国云南与緬甸边境地区，以及安徽、河南等一些中部地区，每年报告总病例数均超过数千例。随着国际交往日益频繁，我国的输入性疟疾病例逐年增加，据统计我国2010年输入性疟疾病例1161例，比2009年上升29.4% ；由于传播媒介疟蚊仍然存在，本地发病病例时有发生，因而疟疾形势仍然十分严峻。加上人们生活方式的改变和活动范围的扩大使间日疟的监测和防控工作具有极大的难度。因此，敏感、特异的诊断试剂研发已成为当前国内外间日疟研发的重点与热点。
[0003]长期以来，在间日疟流行区，各类诊断方法仍不尽如意，或是诊断敏感性不够、或是因特殊设备基层难以使用。以免疫学中抗原-抗体的特异性反应为基础的免疫检测技术一直是疟疾检测的有效方法。以检测疟原虫抗原为靶标的试纸条法(Rapid diagnostictest, RDT) —直被广泛应用于疟疾流行区的病原诊断。但是，目前国内大部分流行区疟疾均处于消除阶段，疟原虫感染率与感染度都非常低，即处于RDT的检测域值范围外，往往会导致漏检。以检测疟原虫抗体为靶标的免疫检测技术，尽管无法区别现症或既往感染，但是由于其检测敏感性很高，可以作为疟疾消除或消除后阶段进行血清流行病学监测的有效工具。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题之一是提供一种间日疟原虫PvMSPl重组抗原，该重组抗原可用于检测间日疟感染病人的血清抗体。
[0005]本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于间日疟原虫PvMSPl基因PCR扩增的特异性引物。
[0006]本发明要解决的技术问题之三是提供该间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法。
[0007]本发明要解决的技术问题之四是提供上述间日疟重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。
[0008]本发明首先通过生物信息学技术和分子生物学技术分析并获得了间日疟原虫PvMSPl的编码基因序列(如SEQ ID NO:2所示)。然后通过对间日疟原虫PvMSPl基因进行扩增，将所得产物与质粒载体pET-28a (+)通过In-Fusion克隆构建重组质粒pET-28a(+)-PvMSPI，转化至DH5a感受态细胞，挑取单菌落进行PCR和测序鉴定；小量抽提测序成功的pET-28a(+)-PvMSPl重组质粒，将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，破碎所得菌体；本发明采用10%SDS溶解蛋白包涵体，由于构建的重组蛋白含6个His，可选用N1-NTA亲和层析纯化重组蛋白，最终得到纯化的重组蛋白PvMSPl，完成了 PvMSPl基因的体外克隆表达及纯化。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0010]本发明第一个方面是提供一种间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白，其具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列。该重组抗原蛋白具有糖基化磷脂酰肌醇(glycophosphatidyl inositol, GPI)锚定及表皮生长因子样(epidermal growthfactor-like, EGF-1ike)结构域，分子量为 Mr42000。
[0011]本发明第二个方面是提供了一对用于间日疟原虫PvMSPl基因PCR扩增的特异性引物，其序列为:
[0012]上游:5'-AATGGGTCGCGGATCCgaccaagtaacaacgggagag-3/ (如 SEQ ID NO:3 所示)；
[0013]下游:5'-GGTGGTGGTGCTCGAGgctacagaaaactccctcaaagag-3'(如 SEQ ID NO:4所示)。
[0014]本发明第三个方面提供了一种间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤:
[0015]I)间日疟原虫PvMSPl基因序列的扩增，PvMSPl基因扩增的具体序列如SEQ IDNO: 2所示(用PCR技术从含有目的基因的间日疟原虫基因组DNA中获得间日疟原虫PvMSPI的DNA片段)；
`[0016]2)间日疟原虫PvMSPl重组质粒的构建和鉴定:用pET_28a(+)载体构建间日疟原虫 PvMSPl 重组表达质粒 pET-28a(+)-PvMSPl ；
[0017]3)将pET-28a(+)_PvMSPl重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白PvMSPl ；
[0018]4)螯合的N1-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白:采用10%SDS将表达获得包涵体蛋白溶解，通过N1-NTA树脂亲和层析表达产物重组蛋白PvMSPl。
[0019]步骤I)具体为:以间日疟原虫基因组DNA作为模板，设计SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。所述PCR扩增的反应条件为98°C预变性2.0min ;98°C变性20sec ;55°C退火30sec，72°C延伸1.0min，35个循环;72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0020]步骤2)具体为:分别使用内切酶Xho I和BamH I酶切pET_28a (+)载体，根据步骤I)所得的PCR产物和酶切后的pET-28a(+)载体的浓度，使用In-Fusion克隆方法连接，构建成PvMSPl编码基因原核表达的重组质粒pET-28a (+) -PvMSPl。将此重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌DH5ci感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，进行菌落PCR鉴定及测序鉴定。
[0021]步骤3)具体为:抽提重组质粒pET_28a(+) -PvMSPl，通过热激法将步骤2)测序无误后的pET-28a(+)-PvMSPl重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21 (DE3)和BL21 (DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养。SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。
[0022]步骤4)具体为:取表达重组蛋白PvMSPl量较高的冻存菌种于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体。在上述菌体中加入向细胞沉淀中加入核酸裂解液裂解细菌(例如，BugBuster蛋白抽提剂)，离心后保留上清液与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果。根据上述结果，用变性剂(例如，10%SDS)裂解所得沉淀，离心后用N1-NTA亲和层析树脂进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。
[0023]本发明第四个方面提供了一种间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。PvMSPl重组蛋白的相对分子质量为42KDa，该重组抗原对间日疟原虫感染血清的诊断敏感性为92.2%，特异性为95.6%(见图6)。实验证明，本发明的PvMSPl重组抗原对疟疾诊断具有敏感性和特异性高等优点，具有较好的诊断价值，为研制相关诊断试剂盒奠定了基础，在疟疾诊断方面具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是实施例1中间日疟原虫PvMSPl基因的PCR扩增结果示意图。图1中，M:DNA分子量标准；1:PvMSPI ο
[0025]图2是实施例1中pET_28a(+)-PvMSPl重组质粒及其菌落PCR鉴定结果示意图。图 2 中，M:DNA 分子量标准；1-4:pET-28a(+)-PvMSPl。
[0026]图3是实施例1中重组质粒间日疟原虫PvMSPl蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图。图3中，M:蛋白分子量标准；1:诱导后菌液；2:裂解后上清；3:裂解后PBS重悬沉淀。
·[0027]图4是实施例1中重组质粒间日痕原虫PvMSPl蛋白的Western_blot鉴定结果示意图。
[0028]图5是实施例1中PvMSPl重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳分析结果示意图。图5中，M:蛋白分子量标准；1:未纯化的PvMSPl重组蛋白；2:流出收集液；3:洗出收集液；
4-11:洗脱收集液。
[0029]图6是实施例2中PvMSPl重组抗原与人血清的反应情况示意图。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0031]实施例1间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备
[0032]I 材料
[0033]1.1间日疟原虫基因组DNA
[0034]来自于被间日疟原虫感染的病人血清红细胞，从云南省疟疾流行区采集。
[0035]1.2宿主菌株大肠杆菌DH5 a、BL21 (DE3)、质粒pET_28a(+)分别来自于天根生化科技有限公司和Novagen公司。
[0036]1.3主要试剂和工具酶
【权利要求】
1.一种间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于间日疟原虫PvMSPl基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为: 上游:5' -AATGGGTCGCGGATCCgaccaagtaacaacgggagag-3'，如 SEQ ID NO:3 所示； 下游:5' -GGTGGTGGTGCTCGAGgctacagaaaactccctcaaagag-3'，如 SEQ ID NO:4所示。
3.—种如权利要求1所述的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: O间日疟原虫PvMSPl基因序列扩增，PvMSPl基因扩增的具体序列如SEQ ID NO: 2所示； 2)间日疟原虫PvMSPl重组质粒的构建和鉴定，采用的重组质粒载体为:pET-28a(+)载体； 3)将重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白； 4)螯合的N1-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白。
4.如权利要求3所述的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤I)具体为:设计SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，提取间日疟原虫总DNA，以其为模板进行PCR扩增。
5.如权利要求4所述的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应条件为98°C预·变性2.0min ;98°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸1.0min, 35个循环；72°C延伸lOmin，最后保存于4°C。
6.如权利要求3所述的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为:将质粒载体pET-28a(+)经Xho I和BamH I双酶切，并回收纯化；根据步骤I)所得的PCR产物和质粒载体酶切片段的浓度进行In-Fusion连接，构建成PvMSPl编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-PvMSPI ;将此重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，将菌液进行PCR鉴定及测序鉴定。
7.如权利要求3所述的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为:通过热激法将步骤2)测序无误后的pET-28a(+)-PvMSPI重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养；SDS-PAGE电泳鉴定诱导表达结果。
8.如权利要求3所述的间日疟原虫PvMSPl重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为:取表达重组蛋白PvMSPl量较高的冻存菌液于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入核酸裂解液裂解细菌，离心后保留上清与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果；根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，离心后用N1-NTA亲和层析树脂进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。
9.一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/30GK103570817SQ201310545600
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】陈军虎, 樊艳婷, 陈绅波, 王越, 张颋, 鞠川, 徐斌, 胡薇 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所