专利名称：可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及寄生虫学和免疫学领域。更具体地，本发明涉及一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体及恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽
背景技术：
疟原虫抗药性的产生和扩散已使全球疟疾疫情严重恶化,每年疟疾死亡人数自上世纪七十年代的约50万上升至目前约100万，药物防治疟疾的措施亦面临严重的困难和挑战。因此新的疟疾控制措施的实施已成为当务之急。疫苗接种已使许多种传染病得到有效的控制乃至根除，因此研制有效的疟疾疫苗成为防止疟原虫感染的重要手段。Pf332蛋白是由疟原虫合成，通过典型的高尔基体分泌途径运输到感染的红细胞表面，由于它是在红内期疟原虫发育晚期时分布到感染红细胞表面的，推测其可能通过影响红细胞的通透性，可塑性及有关功能的改变，促进红细胞膜的裂解和裂殖子的释放。Pf332基因编码大量富含谷氨酸的重复片段，其中五肽分子VTEEI (V)是可被中和抗体识别的表位。Pf332蛋白存在多个B、T细胞表位，可广泛地被人体识别，并诱导人体产生较高的抗体滴度。最近，有研究证明并鉴定Pf332基因由两个外显子组成。外显子I编码的富含半胱氨酸多肽段与恶性疟原虫EBL家族的Duffy-binding-like区具有高度相似性。分布在感染红细胞膜外的这段Pf332-DBL区不仅非常保守，而且在诸如3D7AH1、FCR3S1. 2、7G8的各种恶性疟原虫虫株中均有表达。除此之外，体外培养中Pf332蛋白的表达量与虫体增殖率呈正比，而且抗Pf332-DBL区的多克隆抗体可以显著降低各种虫株的侵入率。作为潜在辅助恶性疟原虫裂殖子侵入红细胞的重要分子Pf332，由于其膜外DBL区与其他膜外区蛋白质相比高度的保守性，使其成为了发展新的抗疟药物和疫苗的候选分子，因此对其功能及生物学作用的研究变得尤为重要。单克隆抗体的特点是理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并成为解决生物学和医学等许多重大问题的主要手段。通过制备单克隆抗体并分析其功能，不仅可以研究蛋白质的主要生物学作用，还可以结合肽扫描技术筛选蛋白质实施功能的关键区域。抗恶性疟原虫蛋白质的单克隆抗体被广泛应用在功能蛋白质生物学作用的研究中。而目前关于抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区的单克隆抗体的制备及可抑制虫体侵入红细胞的单抗的筛选并未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示；
本发明又一个目的是提供一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体，它能与，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽特异性结合；
本发明一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤
1)将Pf332-DBL区基因插入带His标签的载体pQE70中，构建质粒pQE-DBL，并转染至工程菌M15中，表达带His标签的DBL重组蛋白；
2)用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，无菌摘取小鼠脾脏，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合，得杂交瘤细胞株；
3)将DBL片段连接到带GST标签的pGEX-4T-l载体上，并转化入BL21(DE3)中，表达带GST标签的DBL重组蛋白；步骤2)获得的杂交瘤细胞株用带GST标签的DBL重组蛋白进行阳性筛选，筛选出能够分泌抗Pf332-DBL区单抗的杂交瘤细胞株； 4)筛选出的阳性杂交瘤细胞株，再用上述的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽进行阳性筛选，阳性即为一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体。一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332_DBL区单克隆抗体，是编号为Anti-332-mAb8或Anti- 332_mAb7的杂交瘤细胞株分沁的。本发明恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，在生产疟疾的治疗性多肽药物及防治性多肽疫苗中的应用。本发明以恶性疟原虫cDNA为模板，通过PCR扩增，获得Pf332_DBL基因片段，将其分别连接到His标签融合表达载体pQE-70和GST标签融合表达载体pGEX_4T_l中，再分别转化相应宿主菌，进行His标签重组蛋白和GST标签重组蛋白的表达和纯化，分别命名为DBL-His和DBL-GST，为避免在单抗制备过程中筛选到假阳性单抗(即抗His标签抗体)，使用DBL-His作免疫抗原，DBL-GST作筛选用的检测抗原。用DBL-His免疫小鼠，DBL-GST包被ELISA板检测抗体效价，通过常规单抗制备技术获取抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区的单克隆抗体。按照Pf332-DBL区氨基酸序列顺序合成9段多肽，将多肽包被ELISA板，通过肽扫描技术对获得的单克隆抗体识别的区域进行分析，再分别选取识别不同区域的单克隆抗体各一株进行体外抑制恶性疟原虫侵入红细胞的实验。筛选到了具有较强抑制虫体侵入功能的单克隆抗体，发现了 Pf332膜蛋白质DBL区的主要功能区多肽段。本发明一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332_DBL区单克隆抗体，能与恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，特异性结合；它是通过用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合，用带GST标签的DBL重组蛋白初选，再用恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽进行阳性筛选的方法获得；具有较强抑制虫体侵入功能，并且高于从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的MP抗体；不能与其特异性结合的单抗，抑制虫体侵入功能较低或没有此功能。在0. 5mg/mL单抗作用下，能与第I段(其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示)特异性结合的mAb8分泌的单克隆抗体，虫体侵入率为18% ;能与第4段多肽(其氨基酸序列如SEQID No. 2所示)结合的mAb7分泌的单克隆抗体为30%，而从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的MP抗体只有35%，表明这两株单抗具有非常强的抑制虫体侵入红细胞的功能；恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，可以应用于疟疾的治疗性多肽药物的研发及防治性多肽疫苗的研制。
图I纯化的重组抗原SDS-PAGE分析，M:预染marker ； I :DBL_His重组蛋白；2: DBL-GST重组蛋白。图2纯化的重组抗原Western bloting分析,A:DBL_GST重组蛋白；B:DBL_His重组蛋白；
I:Anti-GST 单抗作一抗；2: Anti-Pf332_DBL 多抗作一抗；3:Anti-His 单抗作一抗；4:Anti-Pf332-DBL 多抗作一抗。图3单克隆抗体特异性识别重组抗原DBL-GST的Western bloting分析,M:预染marker ； 1-12: Anti- 332-mAb 1,2,3,4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12 作一抗。图4单克隆抗体特异性识别天然蛋白Pf332的Western bloting分析，M:预染marker “ + ” :虫体蛋白；“一”正常红细胞蛋白。图5单克隆抗体特异性识别天然蛋白Pf332的间接免疫荧光分析，(A) :Anti-GST·单抗及 Anti- 332-mAb 1，2，3，4，5，6 作一抗；(B) : Anti- 332-mAb 7，8，9，10，11，12 作一抗。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例I
重组表达载体pQE-DBL和pGEX-4T-l-DBL的构建
在该实施例中，根据Pf332-DBL区核苷酸序列，合成下列PCR引物
上游引物为5' - GCGAATTCAGCAACATCAACAACAAGG-3'；
下游引物为5' - GCGCGGCCGCTTAGGCGTACTTCTTCTCGA -3'
以恶性疟原虫cDNA为模板，通过上述引物进行PCR扩增，获得Pf332-DBL基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，将其连接到His标签融合表达载体pQE_70中，构建得到重组表达载体pQE-DBL，以进行含His标签的重组蛋白DBL-His的表达。以恶性疟原虫cDNA为模板，通过上述引物进行PCR扩增，获得Pf332_DBL基因片段，将其连接到GST标签融合表达载体pGEX-4T-l中，构建得到重组表达载体pGEX-4T-1-DBL,以进行含GST标签的重组蛋白DBL-GST的表达。为避免在单抗制备过程中筛选到假阳性单抗(即抗His标签抗体)，使用DBL-His作免疫抗原，DBL-GST作筛选用的检测抗原。实施例2
重组抗原DBL-His和DBL-GST的表达及纯化
将实施例I中的重组表达载体pQE-DBL和pGEX -4T-1-DBL分别转化入M15和BL21 (DE3)宿主菌中，分别进行诱导表达后，通过亲和层析法分别纯化DBL-His和DBL-GST重组抗原，进行SDS-PAGE分析(如图I)。以抗His标签单抗或抗GST标签单抗及抗Pf332-DBL的鼠源多抗作一抗对重组蛋白进行Western bloting鉴定，在28kDa和52kDa处分别具有特异性条带(如图2)。DBL-His其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，DBL-GST其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。实施例3
抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区单克隆抗体的制备 (1)动物免疫
免疫方案采用长周期大剂量的方法进行。取5只61周龄雌性BALB/c小鼠，首免采用实施例2中纯化的免疫抗原DBL-His与等量弗氏完全佐剂混合，乳化完全后腹腔注射，剂量为每只小鼠50 yg免疫抗原。之后每隔3周免疫一次，剂量不变，佐剂换为弗氏不完全佐齐U。每次免疫之后1(T14天尾静脉采血，分离血清通过间接ELISA法(实施例2中纯化的检测抗原DBL-GST包被ELISA板)检测特异性抗体效价，直至抗体效价满足细胞融合要求(15X104以上)。融合前3天，腹腔注射小鼠25 Ug纯抗原进行加强免疫；融合前24h，小鼠禁食；
(2)杂交瘤细胞株的制备
在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞，取加强免疫后的小鼠脾脏并制备脾细胞。将脾细胞与Sp2/0细胞按5:广10:1的比例混合放入玻璃离心管，IOOOXg离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管混匀；逐滴滴入0. 8mL 50% PEG溶液,用滴管轻轻吹吸5 6次，30s后，700 Xg离心3min ;逐滴缓慢加入20mL不完全培养基，稀释PEG，使其失去促融作用，然后使离心管底部做划圆运动，2min后，IOOOXg离心5min,弃上清，同法再洗一次；缓慢加入50mL HAT培养基，轻轻混匀，加入到已铺制好饲养层细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔细胞培养板上，每孔加入0. ImL细胞融合悬液，置于37°C，5% CO2培养箱中培养；24小时后，每孔补加0.05mL HAT培养基，并分别在第4天、7天和10天，根据细胞生长情况更换HAT培养基；
(3)杂交瘤细胞株的筛选
100倍镜下观察，待融合细胞集落生长至1/2视野以上时，通过间接ELISA法(检测抗原DBL-GST包被ELISA板)对培养孔中出现的杂交瘤细胞株进行阳性筛选，即筛选出能够分泌抗Pf332-DBL区单抗的杂交瘤细胞株；
(4)杂交瘤细胞株的克隆
用HT培养基将检测结果为阳性的融合细胞轻轻吹起转移至24孔板，10倍稀释，细胞计数；再进行10倍稀释后取100个细胞加入IOmL HT培养基中混匀，将此细胞悬液滴入到已铺制饲养层细胞的96孔培养板内，每孔0. lmL，置于5% CO2温箱，37°C培养；前3天不要移动细胞培养板，以免使细胞离散，第4天时观察每孔细胞集落，对单个、多个细胞克隆的孔分别作出标记并换液一次，第7、10天时根据细胞生长情况再更换HT培养基；100倍镜下观察，待单克隆的细胞集落生长至1/2视野以上时，检测上清抗体效价，对阳性细胞再次克隆，直到所有的克隆细胞孔都为阳性时为止，最终获得12株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞分别命名为 Anti- 332-mAb 1，2，3，4，5,6, 7,8,9, 10，11，12。(5)单克隆抗体的大量制备
将高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，0. 5mL/只，I周后每只小鼠腹腔注射2X IO6个杂交瘤细胞，注射细胞8 10天后，当小鼠腹部膨胀且行动迟缓时抽取腹水，37°C温箱孵育I小时后，4°C过夜，4000 Xg离心lOmin，弃掉脂肪，收集中间澄清腹水，分装冻存备用。
(6)单克隆抗体的纯化
采用ProteinA亲和层析法从小鼠腹水中纯化得到单克隆抗体。(7)单克隆抗体的亚型分类
通过间接ELISA法用单抗亚型分类鉴定试剂盒(SIGMA)鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白 类型及亚型，12株单抗均为IgGl型。实施例4
抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区单克隆抗体的鉴定用实施例3中制备的Anti-332-mAbl，2，3,4, 5,6, 7,8,9, 10，11，12单抗，通过常规Western bloting实验检测重组抗原DBL-GST。结果显示，12株单抗作用下,在52kDa处,均有一条明显的条带(如图3)，表明制得的单抗均可以与重组抗原DBL-GST特异性结合。 用Anti-332-mAbl, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 单抗，通过常规 Western bloting实验检测恶性疟原虫虫体天然蛋白质Pf332的表达。结果显示，12株单抗作用下，虫体蛋白为上样液的泳道上出现了大于250kDa的特异性条带，而在以正常人红细胞为上样液的泳道上却没有条带(如图4)，表明制得的单抗均可以与虫体天然蛋白质Pf332特异性结合。用Anti-332-mAbl, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 单抗，通过常规间接免疫荧光实验检测恶性痕原虫虫体天然蛋白质Pf332的表达。经Hoechst染料复染过的红细胞,如感染虫体，在胞内虫体就呈蓝色荧光，由于红细胞没有核酸物质，因此，正常红细胞不呈现荧光。结果显示，染虫红细胞内虫体呈蓝色荧光，并且以12株单抗为一抗作用的染虫红细胞，在虫体表面或红细胞表面均不同程度的呈现绿色荧光，而抗GST单抗作用的染虫红细胞却没有呈现绿色荧光(如图5)，表明这12株单抗均可以虫体天然蛋白质Pf332特异性结合。实施例5
抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区单克隆抗体识别区域的确定根据Pf332-DBL区氨基酸序列，以25个氨基酸为一段多肽，顺序分成9段多肽，其中最后一段肽为16个氨基酸，由上海生工生物公司合成并偶联BSA。通过间接ELISA法进行肽扫描，进而确定单克隆抗体识别表位所在的肽段。将9段合成的多肽稀释，分别以5 y g/mL, 50 u L每孔包被ELISA板，加入1000倍稀释的抗Pf332_DBL区单抗作为一抗，进行反应并测定OD4tl5值，值最大的孔即为对应的单抗结合肽段。所有的孔OD4tl5值均小于0. 2时，此单抗不结合任何肽段。结果显示，有9株单抗可以结合4段多肽，分别是结合第I段多肽的单抗为mAb3、mAb4、mAb8 ;结合第4段多肽的单抗为mAb7 ;结合第6段多肽的单抗为mAb5、mAblO、mAbll、mAbl2 ;结合第7段多肽的单抗为mAbl ;mAb2、mAb6、mAb9不结合任何肽段，可能是由于它们所结合的区域为多肽段的衔接区。实施例6
具有抑虫作用的抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区单克隆抗体的筛选
(1)对同步化培养后的恶性疟原虫虫体进行镜检，如大部分处于晚期滋养体期，便计算染虫率，并取虫体培养物1000r/min离心5min，弃上清，再用正常红细胞悬液和完全培养基稀释至染虫率为I0/。’红细胞压积为2% ；
(2)将上述稀释好的虫体培养物加入到96孔培养板内，每孔75ii L ;
(3)选取结合第1、4、6、7段多肽和不结合多肽的单克隆抗体各一株，分别为mAb8、mAb7、mAb5、mAbl及mAb9，用完全培养基进行不同倍数稀释，将其加入到具有虫体培养物的孔内，每孔25 il L,每株单抗加入孔中后终浓度为0. 5mg/mL、0. 13 mg/mL、0. 03 mg/mL,每株单抗的每个浓度均设两个重复孔，以终浓度为0. 5mg/mL的MP抗体(从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的抗体)为阳性对照，以未免疫小鼠血清中的IgG为阴性对照，终浓度也为0. 5mg/mL、0. 13 mg/mL,0. 03 mg/mL,阳性对照和阴性对照均设重复孔，同时，其他孔加入25 ii L完全培养基作为对照组；
(4)培养24h后，取虫体培养物用吖啶橙染色并通过流式细胞仪进行计数，每次测定5 X IO4个细胞；
(5)此实验重复三次，测得的染虫率通过以下公式计算相对侵入率。相对侵入率=检测组染虫率/对照组染虫率
结果显示，分别结合第I段和第4段多肽的mAb8和mAb7作用下的虫体相对侵入率最低，具体为0. 5mg/mL单抗作用下mAb8 :18% ；mAb7 :30%,低于0. 5mg/mL MP抗体作用下的35%，表明这两株单抗具有非常强的抑制虫体侵入红细胞的功能，对应的这两段多肽区是Pf332-DBL实施生物学功能的关键区。实施例7
一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体的制备方法
1)将Pf332-DBL区基因插入带His标签的载体pQE70中，构建质粒pQE-DBL，并转染至工程菌M15中，表达带His标签的DBL重组蛋白；
2)用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，无菌摘取小鼠脾脏，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合，得杂交瘤细胞株；
3)将DBL片段通过PCR亚克隆到带GST标签的pGEX_4T_l载体上，并转化入BL21(DE3)中，表达带GST标签的DBL重组蛋白；步骤2)获得的杂交瘤细胞株用带GST标签的DBL重组蛋白进行阳性筛选，筛选出能够分泌抗Pf332-DBL区单抗的杂交瘤细胞株；
4)筛选出的阳性杂交瘤细胞株，再用上述的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，第I段(其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示)或第4段多肽(其氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示)进行阳性筛选，阳性既为一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体。
权利要求
1.恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
2.可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体，其特征在于它能与权利要求I所述的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽特异性结合。
3.可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤 1)将Pf332-DBL区基因插入带His标签的载体pQE70中，构建质粒pQE-DBL，并转化至工程菌M15中，表达带His标签的DBL重组蛋白； 2)用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合，得杂交瘤细胞株； 3)将DBL片段连接到带GST标签的pGEX-4T-l载体上，并转化入BL21(DE3)中，表达带GST标签的DBL重组蛋白；步骤2)获得的杂交瘤细胞株用带GST标签的DBL重组蛋白进行阳性筛选，筛选出能够分泌抗Pf332-DBL区单抗的杂交瘤细胞株； 4)筛选出的阳性杂交瘤细胞株，再用权利要求I所述的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽进行阳性筛选，阳性即为可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体。
4.权利要求2所述的可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体在生产疟疾的治疗性多肽药物及防治性多肽疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体，能与恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，特异性结合；它可以通过用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，将脾细胞与Sp2/0细胞融合，用带GST标签的DBL重组蛋白初选，再用功能性多肽进行阳性筛选的方法获得；具有较强抑制虫体侵入功能，并且高于从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的MP抗体；不能与功能性多肽特异性结合的单抗，抑制虫体侵入功能较低或没有此功能；DBL区功能性多肽，可以应用于疟疾的治疗性多肽药物的研发及防治性多肽疫苗的研制。
文档编号C07K16/20GK102718855SQ201210176879
公开日2012年10月10日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者姜宁, 尹继刚, 杜承, 陆慧君, 陈启军 申请人:吉林大学