专利名称：：具有抗恶性疟原虫活性的三个卡山烷型二萜内酯化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过植物化学提取分离手段从豆科云实属药用植物喙荚云实(CaesalpiniaminaxHance)种子中分离得到三种卡山烷型二萜内酯单体化合物，其中有两个化合物为新化合物。该三个化合物的制备方法和两个新化合物的结构以及三个化合物在制备治疗和/或预防疟疾药物中的应用方面申请专利保护。
背景技术：
：豆科(Leguminosoe)云实属(CaesalpiniaLinn)植物全世界约有100余种，主要分布在亚热带和热带地区，我国约产17种，尤以云实(Caesa-lpiniajaponicaSieb.),喙荚云实(CaesalpiniaminaxHance.)产藏量较大，主要产地在南部和西南部的海南、广东、广西、云南和贵州五省，入药种类达14种(见表1-1)。其中3种，即苏木(CaesalpiniasappanLirm.)、云实、喙荚云实为中国药典及地方标准收载，其他种类为民间用药。该属植物中主要化学成分为黄酮类和卡山烷型二萜(cassane)及其内酯，1985年至今，从该属植物中发现的新二萜类化合物有100多个，主要具有抗疟、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗排斥反应、抗氧化、抗结核等多种生物活性。华南云实(C.cristaL.)的CH2Cl2提取物有显著的抗疟活性。LinnTZ等人从其种皮中分得的CaesalpininC、D、E、F，norcaesalpininA、B、C、D、E,2-acetoxy-3_deacetoxycaesaldekarine,caesalminB、G,caesakdekarinΕ,14(17)dehydrocaesalpinF,2-acetoxycaesaldekarine,7-acetoxy-bonducellpinC者β能显著抑制P.falciparumFCR3/A2生长，其中norcaesalpininE抑制效果最好，14(17)dehydrocaesalpinF^IC50IST^L^E^iiRi(IC50283291nmol/ml)。Dong-MeiLi等(Diterpene-lactonefromtheseedsofCaesalpiniaminaxHance.Chemistry&Biodiversity,2006,3:1260-1265.)报道了化合物neocaesalpinL(III)的结构，但没有进行抗疟的生物活性的研究。本发明所涉及的化合物5α，14β-二羟基-Ia，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯(I)和12α-甲氧基，5α，14β-二羟基_1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯(II)为两个新化合物，其抗疟生物活性为首次发现，化合物neocaesalpinL(III)的抗疟生物活性也为首次发现，迄今为止，以上研究成果尚未发现有专利或文献报道。本发明之目的在于充分利用我国丰富的含有卡山烷型二萜内酯的植物资源，深入进行研究开发，寻找具有独特化学结构，抗疟活性强，且毒副作用小的该类化合物，以期为临床提供新型抗疟药物。
发明内容本实验室利用现代分离技术和结构测定手段对豆科药用植物喙荚云实种子进行化学成分研究过程中，从中分离得到三种卡山烷型二萜内酯单体化合物(化合物I、π、III)，分别是5α，14β-二羟基-Ια，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯(I)禾口12α-甲氧基，5α，14β_二轻基-Ia，6a，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯(II)及化合物neocaesalpinL(III)，其中，化合物I、II为新化合物。通过对这三个化合物进行体外抗疟药效学研究试验，发现其对恶性疟原虫(Plasmodiumfaciparum,P.f.)FCCl分离株具有明显抑制作用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式1本发明的目的之一提供两种新的卡山烷型二萜内酯化合物(化合物I、II)。本发明所涉及的化合物5α，14β-二羟基-Ia，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯(化合物I)禾Π12α-甲氧基，5a，14β-二羟基_1a，6a，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯(化合物II)为两个新化合物，在体外抗疟药效学研究试验中，化合物I、II对恶性疟原虫(Plasmodiumfaciparum,P.f.)FCCl分离株具有明显抑制作用，有较强的抗疟活性，其抗疟生物活性为首次发现。同时，经抗疟药效学研究试验证明，化合物neocaesalpinL(III)具有很强的抗疟生物活性，也为首次发现。迄今为止，以上研究成果尚未发现有专利或文献报道。本发明还提供制备这三种化合物的方法。本发明的技术方案依此包含如下步骤以豆科云实属植物喙荚云实(CaesalpiniaminaxHance.)种子(5.0kg)为原料(见附图1)，用95%乙醇回流提取2次，2h/次，减压回收溶剂，浓缩后得浸膏744g，药渣再用75%乙醇回流提取2次，2h/次，提取液经减压浓缩后得浸膏208g，将全部浸膏合并后得到苦石莲乙醇总提物(952g)。苦石莲乙醇总浸膏用甲醇溶解后，称取100200目硅胶按11的比例与之拌样，混勻烘干备用。称取100200目硅胶536g装入索氏提取器底部，然后再装入拌样后的苦石莲乙醇总提取物(1750g)。依次用4.5L石油醚、2.5L氯仿、3.5L乙酸乙酯、3.5L丙酮、3L甲醇回流提取(提取流程见附图1所示)。将各提取液分别减压浓缩后得到苦石莲乙醇总浸膏的石油醚回流提取层(143g)、氯仿回流提取层(106g)、乙酸乙酯回流提取层(497g)、丙酮回流提取层(15.5g)和甲醇回流提取层(68g)。乙酸乙酯部位浸膏497g按附图2所示流程进行硅胶柱色谱，用氯仿_甲醇不同比例的混合溶剂进行梯度洗脱。其中氯仿甲醇(955)洗脱部分50-57流份继续用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，其中氯仿甲醇(1001)洗脱所得流份49-56用甲醇重结晶得到化合物I(9mg)，梯度8020洗脱所得流份57-76继续用硅胶柱色谱分离，石油醚乙酸乙酯(41)洗脱后的流份92，93，经己烷丙酮重结晶得到化合物II(3mg)。氯仿-甲醇(9010)洗脱部分，58-72流份进行S^hadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，其中流份5-17再进行硅胶柱色谱分离，用氯仿甲醇(301)洗脱的流份42-47再进行SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，收集流份7和8利用硅胶柱色谱进行纯化，石油醚丙酮氯仿(113)的系统洗脱后得到化合物III(15mg)。化合物I白色针状结晶(甲醇)，mpl79180°C，10%浓硫酸乙醇溶液喷洒显黄色单点。HRESI-MS在m/z529.2048处给出分子离子峰[M+Na]+，显示其分子量为506.2048，推测分子式为C26H34Oltl，不饱和度为10。IR光谱显示该化合物分子中存在羟基(3446，3471CHT1)，甲基(1375CHT1)，双键(1674CHT1)，酯羰基(1747cm-1)U1H-WR(SOOMHziCDCl3)谱中可观察到4个甲基信号δ1.50(3Η,s)，1.09(3H，s)，1·12(3H，s)，1.21(3H，s)，3个乙酰基的甲基信号δ2.07(3Η，s)，2.00(3Η，s)，2.11(3H，s)，以及2个烯氢的信号δ5.55(1Η，m)，6.05(1H，s)；13C-WR(125MHz，CDCL3)谱表明化合物V有26个碳原子，从13C-NMR谱上可以观察到4个羰基碳的信号δ170.2，168.8，170.3，169.0(包括1个内酯环上羰基碳信号)和4个烯碳信号δ162.9，150.0，110.7，107.9，提示该化合物分子中含有内酯环结构和两个双键。以上数据表明化合物I具有卡山烷型二萜的骨架特征。在HMBC谱中，δ6.05(1Η，s)与δ150.0(C-12)，162.9(C-13)，169.0(C-16)远程相关，δ5.55(1Η,m)与δ48.0(C-8)，38.3(C-9)，45.1(C-10)，150.0(C-12)，162.9(C-13)远程相关，由此确定双键位置在C-11，C-12位和C-13，C-15位。所有的1H-WR和13C-NMR信号通过HMBC，HMQC都得以归属(见表1)，故化合物鉴定为5α，14β-二羟基-Ia，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯。该化合物为新化合物。化合物II白色针状结晶(甲醇)，mp263267°C，10%浓硫酸乙醇溶液喷洒显黄色单点。HRESI-MS在m/z561.2360处给出分子离子峰[M+Na]+，显示其分子量为538.2360，推测分子式为C27H38O11,不饱和度为9。IR光谱显示该化合物分子中存在羟基(3461CHT1)，甲基(1375CHT1)，双键(1652CHT1)，酯羰基(1743cm-1)U1H-WR(SOi)MHz,CD3OD)谱中可观察到4个甲基信号δ1.11(3Η,s)，l.12(3H,s)，1.15(3H,s)，1.50(3H，s)，3个乙酰基的甲基信号δ2.12(3Η，s)，1.93(3Η，s)，2.02(3H，s)，以及1个烯氢信号δ6.00(1Η，s)；13C-NMR(125MHz,OT3OD)谱表明化合物II有27个碳原子，从13C-NMR上可以观察到4个羰基碳的信号δ172.3，172.5，172.9，172.4(包括1个内酯环上羰基碳的信号)和2个烯碳信号δ176.2,117.8。以上数据表明化合物II具有卡山烷型二萜的骨架特征。将该化合物的ID-NMR数据与neocaesalpinL比较(见表1)，发现二者非常相似，仅C-12上取代基的不同。化合物II的1H-NMR谱在δ3.16处给出一个甲氧基的信号；从13C-NMR谱来看，二者的差异在于该化合物C-12的化学位移值δ109.0较neocesalpinL的C-12化学位移值δ107.0明显增大，而C-15的化学位移值δ114.7则较neocaesalpinL的C-15化学位移值δ117.8减小，且在δ51.8处给出一个甲氧基的碳信号。在HMBC谱中，δ6.00(1Η，s)与δ109.0(C-12)，δ176.2(C-13)远程相关，显示双键位置在C-13，C-15位；δ3.16(3Η，s)与δ109.0(C-12)，δ1.37(1Η,t)与δ109.0(C-12)禾口δ51.8(-OCH3)远程相关，则说明-OCH3连在C-12位上，具体相关(见图3-4)。所有的1H-NMR和13C-NMR信号通过HMBC，HMQC都得以归属(见表1)，故化合物II鉴定为12α-甲氧基，5α，14β-二羟基-Ια，6α，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯。化合物III白色针状结晶(甲醇)，mpl98200°C，10%浓硫酸乙醇溶液喷洒显黄色单点。ESI-MS谱显示其分子离子峰m/z524，推测其分子式为C26H36O11。从1H-NMR(500MHz，CD3OD)谱中可观察到4个甲基信号δ1.11(3Η,s,H-18)，1.12(3H,s,H-19)，1.16(3H,s,H-20)，1.52(3H,s,H—17)，3个乙酰基的甲基信号δ2.02(3Η,s,I-OCOCH3)，1.93(3H,s,6-0C0CH3),2.13(3H,s，7_0C0CH3)，以及1个内酯环上双键氢的信号δ5.80(1H，s，Η-15)；13C-WR(125MHz，CD3OD)谱显示3个乙酰基信号δ21.7(I-OCOCH3)，172.3(I-OCOCH3)，22.1(6-0C0CH3)，172.6(6_0C0CH3)，22.0(7_0C0CH3)，172.9(7_0C0CH3)。内酯环上1个羰基碳的信号S172.4和2个双键碳信号δ178.9，114.7。以上数据显示该化合物具有卡山烷型二萜的骨架特征。将该化合物1H和13C-NMR数据(见表1.)与neocaesalpinL(Dong-Mei,etal.CassaneDiterpene-IactonefromtheseedsofCaesalpiniaminaxHance.Chemistry&Biodiversity，2006，3:1260-1265.)比较，数据一致。故化合物III鉴定为neocaesalpinL.表1.化合物I，II和IIIL匪R(500MHz)和13C-WR(125MHz)数据(inCD3OD)~~IIIIII_^(multility^)_δ_Sh(multility,J)_δ_δΗ(multility’·/)_8C15.10(lH，d,J=3.0Hz)74.04.83(lH，d,J=3.0Hz)73.74.84(lH,d’J=6.5Hz)76.822.03(lH,m,Hp),22.61.99(1H,m,Hp),24.01.98(lH，d,_T=2.5Hz，Hp)23.91.77(111，1101)1.65(lH，m,Ha)1.68(lH,m,Ha)31.82(1H,m,Hp),32.31.88(1H,m,Hp),33.81.86(lH’d，J=14.5，3.0Hz，Hp)33.8LlS(IHiIiiiHct)1.05(1H,m,Ha)1.06(1H,CijJ=M-OHz5Ha)438.640.039.9579.380.480.565.55(lH,m)74.45.45(1H,d,J=8.0Hz)76.25.45(lH,d,J=3.0Hz)77.375.70(lH，s)71.95.69(lH，s)77.25.69(lH,s)73.482.27(1H,m)48.01.95(lH，m)52.81.89(lH,m)52.193.30(lH,d，J=10.5Hz)38.32.77(lH，td，J=10.5Hz)35.22.79(lH，td，J=12.5，2.5Hz)35.61045.146.349.0115.55(1H,m)107.92.03(lH，d，J=2.5Hz，Hp)，39.01.96(lH,d,J=2.5Hz,H)39.11.37(lH,t,J=12.8Hz,Ha)1.30(lH，t，J=12.5Hz,Ha)12150.0109.0107.013162.9176.2178.91472.676.776.1156.05(lH,s)110.76.00(lH,s)117.85.80(3H,s)114.716169.0172.3172.4171.50(3H，s)21.21.50(3H,s)20.21.52(lH,s)21.2181.09(3H，s)29.9l.ll(3H，s)31.4l.ll(3H，s)31.4191.12(3H，s)23.71.12(3H，s)25.31.12(3H,s)25.3201.21(3H，s)18.91.15(3H，s)17.71.16(lH’s)17.812-OMe3.16(3H,s)51.8I-OAc2.07(3H,s)170.2，2.12(3H,s)171.2,2.02(3H，s)172.4,21.221.621.76-OAc2.00(3H,s)170.3，1.93(3H，s)172.5，1.93(3H,s)172.6,21.522.122.17-OAc2.11(3H，s)168.8,2.02(3H，s)172.9，2.13(3H,s)172.9，_2Z5_220_22.0本发明进一步涉及式1所述的三个卡山烷型二萜内酯单体化合物在制备治疗和/或预防疟疾药物中的应用。本发明经过实验证明本发明化合物具有治疗和/或预防疟疾的作用，本发明进行了体外抗疟药效学研究试验，试验采用恶性疟原虫(Plasmodiumfaciparum,P.f.)FCC1分离株，试验如下建立恶性疟原虫(Plasmodiumfaciparum，P.f.)FCCl分离株体外培养体系。完全的疟原虫培养基为含25mMHEPES、23.8mMNaHC03、50mg·L—1庆大霉素及10%兔血清的RPMI1640。“0”型红细胞用完全培养基稀释至红细胞比容为5%。培养条件为37°C、5%CO2,5%02及90%队。生长稳定后，用5%甘露醇进行同步化处理，一个周期后(约48小时)再次用甘露醇处理，同步化后继续培养28-30小时，至生长为成熟裂殖体期。调整最终的红细胞比容为5%，原虫血症为0.5-1%。将原虫培养物调整至0.5-1%原虫血症，红细胞比容为5%，按照50μ1每孔分装入96孔板。所有样品用DMSO溶解稀释后，按不同浓度分别加入小孔，在二氧化碳培养箱中培养24-30小时后，取每孔中的培养物涂厚血片，吉姆萨染色后显微镜观察原虫血症的变化。MicrosoftExcel2003整理数据，STATA7.0进行统计处理和分析，并用GraphpadPrism进行非线性回归的曲线拟合后得到各样品的IC50及其95%可信区间。表2.化合物I，II和III对恶性疟原虫的半数抑制浓度和95%可信区间<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实验结果表明样品I和II具有较好的抗疟活性，样品III有很强的抗疟活性。图1喙荚云实种子乙醇总浸膏不同极性部位的提取流程2卡山烷型二萜内酯化合物I，II和III的制备流程；图3化合物I的HRESI-MS谱；图4化合物I的1H-NMR谱；图5化合物I的13C-WR谱；图6化合物I的HMBC谱；图7化合物I的HMQC谱；图8化合物II的HRESI-MS谱；图9化合物II的1H-NMR谱；图10化合物II的13C-WR谱；图11化合物II的HMBC谱；图12化合物II的HMQC差谱；图13化合物III的HRESI-MS谱；图14化合物III的1H-NMR谱；图15化合物III的13C-WR谱；图16化合物III的HMBC谱；图17化合物III的HMQC谱。具体实施例方式下面所实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例化合物的制备以豆科云实属植物喙荚云实(CaesalpiniaminaxHance.)种子(5.Okg)为原料(见附图1)，用95%乙醇回流提取2次，2h/次，减压回收溶剂，浓缩后得浸膏744g，药渣再用75%乙醇回流提取2次，2h/次，提取液经减压浓缩后得浸膏208g，将全部浸膏合并后得到苦石莲乙醇总提物(952g)。苦石莲乙醇总浸膏用甲醇溶解后，称取100200目硅胶按11的比例与之拌样，混勻烘干备用。称取100200目硅胶536g装入索氏提取器底部，然后再装入拌样后的苦石莲乙醇总提取物(1750g)。依次用4.5L石油醚、2.5L氯仿、3.5L乙酸乙酯、3.5L丙酮、3L甲醇回流提取(提取流程见附图1所示)。将各提取液分别减压浓缩后得到苦石莲乙醇总浸膏的石油醚回流提取层(143g)、氯仿回流提取层(106g)、乙酸乙酯回流提取层(497g)、丙酮回流提取层(15.5g)和甲醇回流提取层(68g)。乙酸乙酯部位浸膏497g按附图2所示流程进行硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇不同比例的混合溶剂进行梯度洗脱。其中氯仿甲醇(955)洗脱部分50-57流份继续用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，其中氯仿甲醇(1001)洗脱所得流份49-56用甲醇重结晶得到化合物I(9mg)，梯度8020洗脱所得流份57-76继续用硅胶柱色谱分离，石油醚乙酸乙酯(41)洗脱后的流份92，93，经己烷丙酮重结晶得到化合物II(3mg)。氯仿-甲醇(9010)洗脱部分，58-72流份进行S^hadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，其中流份5-17再进行硅胶柱色谱分离，用氯仿甲醇(301)洗脱的流份42-47再进行SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，收集流份7和8利用硅胶柱色谱进行纯化，石油醚丙酮氯仿(113)的系统洗脱后得到化合物III(15mg)。权利要求具有抗恶性疟原虫活性的两个新的卡山烷型二萜内酯化合物，其特征在于其是由豆科药用植物喙荚云实种子中提取分离得到的，化学结构式为按照权利要求1所述的两个新的卡山烷型二萜内酯化合物，其特征在于化合物Ⅰ为5α，14β-二羟基-1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯，其分子式为C26H34O10，分子量为506.2152(计算值)，系白色无定型粉末状；化合物Ⅰ为新化合物。化合物Ⅱ为12α-甲氧基，5α，14β-二羟基-1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯，其分子式为C27H38O11，分子量为538.2414(计算值)，系白色无定型粉末状；化合物Ⅱ为新化合物。F2009100093734C0000011.tif2.权利要求1所述的两个新的卡山烷型二萜内酯化合物经抗疟药效学试验证明，具有较好的抗疟活性。同时，从豆科药用植物喙荚云实种子中提取分离得到的化合物III为neocaesalpinL(5，12，14-三羟基-1，6，7_三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯)也属于卡山烷型二萜内酯化合物，其分子式为C26H36O11,分子量为524.2258(计算值)，系白色无定型粉末状。首次对化合物III(neocaesalpinL)进行抗疟药效学试验，证明该化合物具有很强的抗疟活性。3.权利要求1所述的两个新的卡山烷型二萜内酯化合物(化合物I、II)及权利要求2所述的卡山烷型二萜内酯化合物(化合物III)的制备方法，包括以下步骤干燥苦石莲粉末，分别用95%和75%乙醇回流提取，减压回收溶剂，合并浸膏后得到苦石莲乙醇总提取物，硅胶与之拌样后装入索氏提取器，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇回流提取，将各提取液分别减压浓缩后得到苦石莲乙醇总浸膏的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇回流提取部位。乙酸乙酯部位经反复硅胶柱色谱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析和重结晶纯化得到化合物5α，14β-二羟基_1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯(I)，12α-甲氧基，5α，14β-二羟基_1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯(II)和neocaesalpinL(III)。4.权利要求1所述的两个新的卡山烷型二萜内酯化合物(化合物I、II)及权利要求2所述的卡山烷型二萜内酯化合物(化合物III)在制备治疗和/或预防疟疾药物中的应用，所述卡山烷型二萜内酯化合物分别是5α，14β-二羟基-Ια，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯、12α-甲氧基，5α，14β-二羟基-Ια，6α，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯、neocaesalpinL(5a，12a，14β-三羟基-la,6a，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯)。全文摘要本发明涉及一类具抗恶性疟原虫活性的卡山烷型二萜内酯化合物，是以豆科药用植物喙荚云实的种子为原料，用特定溶剂提取，经各种色谱层析，得到三个卡山烷型二萜内酯单体化合物，分别为5α，14β-二羟基-1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)，11(12)-二烯-16，12-内酯(Ⅰ)，12α-甲氧基，5α，14β-二羟基-1α，6α，7β-三乙酰基-13(15)-烯-16，12-内酯(Ⅱ)和neocaesalpinL(Ⅲ)，其中化合物Ⅰ和Ⅱ为新化合物。首次对这三个化合物体外抗疟药效学的研究试验表明，其对恶性疟原虫具有明显抑制作用，可用于制备治疗和/或预防疟疾药物。文档编号C07D307/77GK101812041SQ20091000937公开日2010年8月25日申请日期2009年2月20日优先权日2009年2月20日发明者程燕,缪剑华,袁经权,许娜,许旭东,马丽焱申请人:中国医学科学院药用植物研究所;广西壮族自治区药用植物园