离体快繁中华蓑藓配子体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种离体快繁中华蓑藓配子体的方法，其包括以下顺序步骤：1)将生长于自然环境中的中华蓑藓成熟孢蒴表面消毒后，接种到无任何激素的改良Knop′s培养基上培养获得原丝体，再进行培养30天后获得配子体；2)将配子体单枝接种到用于配子体继代增殖的培养基上，培养获得新生配子体。本发明首次建立了离体快繁中华蓑藓配子体的方法，使用本发明的离体快繁方法，可以在短时间内实现人工大量扩繁中华蓑藓配子体。该项发明科研意义和实际利用价值明显，可以为利用苔藓植物指示和监测大气污染提供大量生长均一的理想试验材料。同时，也可以源源不断地为应用苔藓植物进行园林造景提供丰富的种苗，如建立苔藓园。
【专利说明】离体快繁中华蓑藓配子体的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用植物组织培养技术进行离体快繁中华蓑藓配子体的方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]木灵藓科(Orthotrichaceae)養藓属(MacramitriumBridel)是泛热带分布的类群。中国的蓑藓属植物种类非常丰富，目前被接受的有40余种。其中中华蓑藓(Macromitrium cavaleriei Card.&Ther.)是 Cardot 在 1906 基于 J.Cavalerie 从贵州(Kouy Techeou)采集的标本描述的新种，记录于我国西南地区狭窄的分布区域,该种的主要特点是树附生，茎叶湿润状态下常反折或近贴茎，椭圆状披针形到三角状披针形，先端渐尖；枝叶线状或卵圆状披针形至披针形，多数渐尖或狭渐尖，有的枝叶阔渐尖；叶片中部和上部细胞膨胀状，薄壁，细胞之间界线清楚，有2~4个小疣或近光滑无疣，叶片下部细胞菱形状、长方形或亚条形状，光滑或具有一单疣；内苞叶椭圆形披针形，狭渐尖至长渐尖芒状，钟形蒴帽，具黄色毛。
[0003]苔藓植物是世界上重要的植物群之一，因为他的体积十分的小而且缺少俗名，它们的美丽和多样性常常被人们忽略。全世界苔藓植物数量现有23000多种，我国苔藓植物种类也比较丰富，约有2800多种。
[0004]苔藓植物在生态环境方面有着自己独特的作用。苔藓植物能够作为环境变化的综合性指示植物，这是因为它们对于自然条件较为敏感，所以使得苔藓植物成为监测大气污染的指示植物。苔藓植物拥有很强大的吸水能力，尤其是当密集丛生时，其吸水量高时可达植物体干重的15 — 20倍，而其蒸发量却只有净水表面的1/5。因此，在干旱地区通过种植苔藓植物在土表结皮，防止土壤水分散失的同时又可起到固沙的重要的作用。随着时代文明程度的提升，人们对于生态环境的要求，对于美的追求都越来越高。苔藓，作为无维管束植物，在我们的生活中可谓是随处可见，是十分具有观赏性的绿色植物，其在园林造景方面有着自己的一席之地。园林中人们利用苔藓植物结合其他造园要素，如山石，树木，小品等，可以创造出一种充满生活情趣的园林景观。
[0005]通过植物组织培养方式，建立中华蓑藓快繁系统，既可以为利用中华蓑藓指示和监测大气污染提供理想的试验材料，也可以为应用中华蓑藓进行园林绿化和造景提供丰富种源。目前现有技术中还没有关于中华蓑藓在试管瓶内大量扩繁配子体的培养技术，也没有通过利用中华蓑藓孢朔离体培养获得配子体的相关研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用植物组织培养技术离体快繁中华蓑藓配子体的方法，以填补现有技术的空白，实现人工大量快速扩繁中华蓑藓配子体。
[0007]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0008] 本发明公开的组织培养快繁中华蓑藓配子体的方法包括以下顺序步骤:[0009]I)将中华蓑藓孢蒴表面灭菌后，接种到无任何激素的改良Knop ' s培养基上，用无菌器械破碎孢蒴使孢子释放，培养10天后，孢子萌发产生原丝体，再培养30天后，经原丝体分化获得配子体，培养条件为:温度23±2°C，光照强度2000±2501x，光照时间14小时/天；所述无任何激素的改良Knop ' s培养基配方为:改良Knop ' s基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，其中改良Knop ' s基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgSO4.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (NO3) 2.4H201000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe-EDTA36.7mg/L、MnS04.4Η2011.15mg/L、H3B033.lmg/L、K10.415mg/L、ZnS04 *7H204.3mg/L、CuSO4.5H200.0125mg/L、NaMoO4.2H200.125mg/L、CoCl2.6H200.0125mg/L ；
[0010]2)将步骤I)培养得到的配子体单株接种到配子体增殖扩繁的培养基上，进行培养30天，培养条件为:温度23±2°C，光照强度2000±2501x，光照时间14小时/天；所述配子体增殖扩繁的培养基配方为:1/3MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，其中MS基本培养基配方为:KN031900mg/L、NH4N031650mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO4170mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、H3B036.2mg/L、K10.83mg/UNaMoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L、Na2_EDTA37.3mg/L、FeSO4.7H2027.8mg/L、NaFe_EDTA36.7mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L ；1/3MS基本培养基是指大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/3，其中大量元素化合物为:KN03、NH4NO3^ MgSO4.7H20、KH2PO4,CaCl2.2H20。
[0011]步骤(1)中对孢蒴进行表面灭菌的优选灭菌剂组合和灭菌时间为75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液5分钟。 [0012]步骤(1)中切取的孢蒴来源于野外生长的中华蓑藓配子体上生长的孢蒴。
[0013]上述步骤中的培养条件均优选:温度23°C，光照强度20001x，光照时间14小时/天。
[0014]步骤2)中中华蓑藓配子体大量扩繁的培养基pH为6.0。
[0015]本发明的有益效果为:首次建立了离体快繁中华蓑藓配子体的方法，填补了现有技术的空白；并且，使用本发明的离体快速扩繁方法，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产；在短时间内可实现人工大量扩繁中华蓑藓配子体，既可以为利用中华蓑藓指示和监测大气污染提供理想的试验材料，也可以为应用中华蓑藓进行园林绿化和造景提供丰富种源。科研与应用价值明显。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明:
[0017]实施例1
[0018]剪取生长于自然环境中的中华蓑藓孢蒴进行表面消毒，消毒剂为75%体积分数的酒精溶液和0.1 %体积分数的升汞溶液；消毒后，将无菌孢蒴里的孢子接种到无任何激素的改良Knop' S培养基进行培养，以获得无菌原丝体，再培养30天后，经原丝体分化获得配子体。培养条件为:温度23°C，光照强度20001x，光照时间14小时/天，培养10天后观察
培养结果。
[0019]按常规方法制备75%体积分数的酒精溶液和0.1 %质量体积分数的升汞溶液，用于中华蓑藓配子体的表面灭菌，灭菌剂组合和灭菌时间为以下3种:
[0020]a) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液3分钟；
[0021]b) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液5分钟；
[0022]c) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液10分钟；
[0023]按常规方法制备无任何激素的改良Knop' s培养基，用于诱导孢子萌发形成原丝体的培养。培养基配方组成为:改良Knop' s基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉。
[0024]所述改良Knop ' s 基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgSO4.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (NO3) 2.4H201000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe_EDTA36.7mg/L、MnSO4.4H2011.15mg/L、H3B033.lmg/L、KI0.415mg/L、ZnSO4.7H204.3mg/L、CuSO4.5H200.0125mg/L、NaMoO4.2H200.125mg/L、CoCl2.6H200.0125mg/L ；
[0025]孢蒴灭菌结果如下:
[0026]a) 75 %体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液3分钟灭菌处理后，无菌原丝体获得率28.8%，污染原丝体获得率67.4%，孢子未萌发率3.8% ;
[0027]b) 75 %体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液5分钟灭菌处理后，无菌原丝体获得率62. 2%，污染原丝体获得率22.6%，孢子未萌发率15.2%;
[0028]c) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液10分钟灭菌处理后，孢子未萌发率100% ；
[0029]比较上述灭菌结果可以看出:75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升汞溶液5分钟灭菌处理后，中华蓑藓孢子无菌原丝体获得率最高，达到62.2%。
[0030]实施例2
[0031]将实施例1得到的配子体单株接种到配子体增殖扩繁的培养基上，培养30天。培养条件为:温度23°C，光照强度20001χ，光照时间14小时/天。
[0032]按常规方法制备诱导分化配子体产生的培养基，培养基配方组成为以下14种:
[0033]a)改良Knop' s基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；
[0034]b)l/2改良Knop' s基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/2) +10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0035]c)l/3改良Knop' s基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/3) +10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0036]d)l/4改良Knop' s基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/4) +10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0037]e) MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；
[0038]f) 1/2MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的l/2)+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；
[0039]g) 1/3MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的l/3)+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；
[0040]h) 1/4MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的l/4)+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉；
[0041]i)改良 Knop' s 基本培养基-125mg/L KN03+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0042]j)改良 Knop' s 基本培养基 +125mg/L KN03+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；[0043]k)改良 Knop' s 基本培养基 _500mg/L Ca (NO3) 2 *4H20+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0044]I)改良 Knop' s 基本培养基 +500mg/L Ca (NO3) 2 *4H20+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0045]m)改良 Knop' s 基本培养基-125mg/L KH2P04+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉；
[0046]η)改良 Knop' s 基本培养基 +125mg/L KH2P04+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉。
[0047]所述改良Knop ' s 基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgSO4.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (NO3) 2.4H201000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe_EDTA36.7mg/L、MnSO4.4H2011.15mg/L、H3B033.lmg/L、KI0.415mg/L、ZnSO4.7H204.3mg/L、CuSO4.5H200.0125mg/L、NaMoO4.2H200.125mg/L、CoCL2.6H200.0125mg/L ；
[0048]所述MS 基本培养基配方为:KN031900mg/L、NH4N031650mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2P04170mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MnSO4 *4H2022.3mg/L、ZnS04 *7H208.6mg/L、H3B036.2mg/L、KI0.83mg/L、NaMoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、FeSO4.7H2027.8mg/L、NaFe_EDTA36.7mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L ;其中大量元素化合物为:KN03、NH4NO3、MgSO4.7H20、KH2PO4'CaCl2.2H20。
[0049]培养30天时的观察结果如下:
[0050]a)改良Knop' s基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓颜色棕绿，生长旺盛，配子体新生分 枝较长，分枝茎叶形态正常。有很少量原丝体的产生，并且有大量的假根产生；
[0051]b)l/2改良Knop' s基本培养基(大量兀素化合物的用量为配方规定用量的1/2) +10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓颜色棕色，生长缓慢，配子体新生分枝较长，分枝数量少。一级分枝细长二级分枝短小，观察到有极少量原丝体的产生，并且有较多的假根产生；
[0052]c)l/3改良Knop' s基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的l/3)+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓颜色棕绿，生长缓慢，配子体新生分枝中，一级分枝细长而二级分枝很少很短小，观察到有极少量原丝体的产生，并且有较多的假根产生;
[0053]d)l/4改良Knop' s基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的l/4)+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓颜色嫩棕绿，生长及其缓慢，配子体新生分枝中，一级分枝细小，没有二级分枝的产生。没有原丝体的产生，也没有假根产生；
[0054]e)MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓的配子体新生分枝较粗壮，但分枝形态丛状，整体颜色褐绿色。新生分枝特别多，只有极其少量的原丝体和假根的形成；
[0055]f) 1/2MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华中华蓑藓的配子体新生分枝较粗壮，分枝形态丛状，一级分枝和二级分支都较为粗短。有极少量的原丝体和假根形成；
[0056]g) 1/3MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓的分枝较粗壮，生长速度快，有较多的新生分枝，分枝形态丛状，一级分枝较长，二级分支较也比较长。颜色绿中带棕，有极少量的原丝体形成，同时也伴生很少量的假根；
[0057]h) 1/4MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓的配子体新生分枝形态正常，其中一级分枝较细长，二级分支较为粗短，整体颜色绿中带棕，有极少量的原丝体形成，有很多的假根。
[0058]i)改良Knop' s基本培养基-125mg/L KN03+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓颜色棕绿，生长缓慢，配子体新生分枝中，一级分枝细长而二级分枝很少较短，观察到有较多原丝体的产生，有极少的假根产生；
[0059]j)改良Knop' s基本培养基+125mg/L KN03+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓颜色葱绿，生长缓慢，配子体新生分枝中，一级分枝细长且数量不多，而二级分枝很少且极短，观察到有少量原丝体的产生，没有假根产生；
[0060]k)改良 Knop' s 基本培养基-500mg/L Ca (NO3) 2.4H20+10g/L 鹿糖 +6g/L 琼脂粉中，中华蓑藓颜色葱绿，生长缓慢，配子体新生分枝中，一级分枝细长且数量极少，没有二级分枝产生，且没有原丝体和假根产生；
[0061 ] I)改良 Knop' s 基本培养基 +500mg/L Ca (NO3) 2.4H20+10g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂粉中，中华蓑藓呈褐色，生长极慢，配子体新生分枝中，一级分枝少而短小，没有二级分枝的产生，观察到有少量原丝体的产生，并且有极多的假根产生；
[0062]m)改良Knop' s基本培养基-125mg/L KH2P04+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓生长极慢，基本没有新生配子体产生，一级分枝极少而短小，没有二级分枝的产生，观察到有少量原丝体的产生，没有假根产生；
[0063]η)改良Knop' s基本培养基+125mg/L KH2P04+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉中，中华蓑藓的配子体新生分枝较粗壮，分枝形态丛状，一级分枝和二级分支都较为粗短。有较多的原丝体产生，基本没有假根形成。
[0064]比较上述培养结果可以看出，在改良Knop^ s基本培养基和MS基本培养基基础上，增加或减少不同大量元素化合物的用量，以及无机盐含量的不同，对诱导中华蓑藓配子体分化形成新生配子体有很大影响。当大量元素化合物的用量为MS配方规定用量的1/3时，既有利于新生配子体的形成又有利于新生配子体的生长。
【权利要求】
1.一种离体快繁中华蓑藓配子体的方法，其特征在于，所述方法包括以下顺序步骤: 1)将中华蓑藓孢蒴表面灭菌后，接种到无任何激素的改良Knop'S培养基上，用无菌器械破碎孢蒴使孢子释放，培养10天后，孢子萌发产生原丝体，再培养30天后，经原丝体分化获得配子体，培养条件为:温度23±2°C，光照强度2000±2501x，光照时间14小时/天；所述无任何激素的改良Knop ' s培养基配方为:改良Knop ' s基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，其中改良Knop ' s基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgSO4.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (NO3) 2.4H201000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe-EDTA36.7mg/L、MnS04.4Η2011.15mg/L、H3B033.lmg/L、K10.415mg/L、ZnS04 *7H204.3mg/L、CuSO4.5H200.0125mg/L、NaMoO4.2H200.125mg/L、CoCl2.6H200.0125mg/L ； 2)将步骤I)培养得到的配子体单株接种到配子体增殖扩繁的培养基上，进行培养30天，培养条件为:温度23±2°C，光照强度2000±2501x，光照时间14小时/天；所述配子体增殖扩繁的培养基配方为:1/3MS基本培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，其中MS基本培养基配方为:KN031900mg/L、NH4N031650mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO4170mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、H3B036.2mg/L、K10.83mg/UNaMoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L、Na2_EDTA37.3mg/L、FeSO4.7H2027.8mg/L、NaFe_EDTA36.7mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L ；1/3MS基本培养基是指大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/3，其中大量元素化合物为:KN03、NH4NO3^ MgSO4.7H20、KH2PO4,CaCl2.2H20。
2.根据权利要求1所述的离体快繁中华蓑藓配子体的方法，其特征在于，步骤(1)中对孢蒴进行表面灭菌的优选灭菌剂组合和灭菌时间为75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1 %质量体积分数的升萊溶液5分钟。
3.根据权利要求1所述的离体快繁中华蓑藓配子体的方法，其特征在于，步骤(1)中切取的孢蒴来源于野外生长的中华蓑藓配子体上生长的孢蒴。
4.根据权利要求1所述的离体快繁中华蓑藓配子体的方法，其特征在于，所述方法中所有步骤中的培养条件均优选--温度23°C，光照强度20001x，光照时间14小时/天。
5.根据权利要求1所述的离体快繁中华蓑藓配子体的方法，其特征在于，步骤2)中配子体增殖扩繁的培养基配方pH为6.0。
【文档编号】A01H4/00GK103999772SQ201410217784
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】娄玉霞, 丁雪, 郭水良 申请人:上海师范大学