恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量pcr检测试剂盒及核苷酸序列的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列，设计了恶性疟原虫特异的引物和探针，优化了实时荧光PCR检测体系；针对恶性疟原虫的一对引物，结合普通PCR技术和分子克隆技术，构建了恶性疟原虫质粒标准品，建立了目的基因拷贝数与荧光检测信号之间关系的标准曲线，实现了恶性疟原虫的实时荧光定量检测。本试剂盒将纳米磁微粒分离疟原虫核酸技术与实时荧光定量PCR技术有机结合，在标本核酸提取方面具有操作方便、价廉、快捷、高效的特点，尤其在滤纸干血片核酸提取和提取微量全血核酸方面具有很大优势，实现了扩大检测范围、最大程度降低漏检率的目标，本试剂盒的检测限为25copies/μL。
【专利说明】恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列
【技术领域】
[0001]本发明属于检验检疫领域，但不限于该领域，涉及检测临床样品中恶性疟原虫，是一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列。
【背景技术】
[0002]疟疾是对人类健康危害最严重的传染病之一，疟疾病例中有86%发生在非洲地区，非洲以外地区的疟疾病例80%集中在印度、苏丹、緬甸、孟加拉、印度尼西亚、巴布亚新几内亚和巴基斯坦等国。非洲以恶性疟为主，间日疟分布最广，遍及热带、亚热带、温带的国家和地区，以中美洲和东南亚为多见。[0003]我国自2000年以来疟疾疫情出现回升，其中云南、海南两省较为严重，许多省受到输入性恶性疟的威胁，尤其是境外输入性恶性疟的威胁。随着经济全球化和国际交往的增多，近年来劳务输出人数逐年增加，输入性疟疾病例逐年增多，呈逐年上升趋势。输入性病例大多源于非洲、緬甸等恶性疟高发区劳务输出的归国人员，2008年我国疟疾死亡病例全部为境外劳务回国人员，2009年有21个省(市、区)有输入性恶性疟病例报告，且疟疾死亡也全部为输入病例。因此,关注疟疾疫情,特别是境外输入性恶性疟疫情十分重要。
[0004]2009年全国报告恶性疟1027例，占疟疾总报告病例数的7.4%。其中，当地感染的恶性疟130例，占恶性疟报告病例数的12.7%，输入性恶性疟病例897例，占恶性疟报告病例数的87.3%。2010年全年报告恶性疟1258例，占疟疾总报告病例数的16.0%，其中报告当地感染的恶性疟97例，占恶性疟报告病例数的7.7%，报告输入性恶性疟1161例，占恶性疟报告病例数的92.3%，较上年上升29.4%。输入性恶性疟最主要的感染地为东南亚地区和非洲。东南亚有緬甸、柬埔寨、巴基斯坦、印度、印度尼西亚、马来西亚等国家。非洲地区有尼日利亚、安哥拉、马里、加纳、几内亚、赤道几内亚、刚果、利比里亚、利比亚、马拉维、多哥、喀麦隆、莫桑比克、科特迪瓦、南非和肯尼亚等国家，其中东南亚的緬甸，非洲地区的尼日利亚、安哥拉、几内亚、赤道几内亚，是我国输入性恶性疟最多的国家。
[0005]恶性疟来势凶险，临床表现复杂多变，热型不规则，起病方式各异，有的表现为呼吸道感染，有的表现为消化道感染，有的表现为急腹症。并且恶性疟可随时出现严重并发症，如脑型疟、急性血管内溶血(亦称黑尿热)等，容易引起误诊，若不及时救治，可出现意识障碍、昏迷、偏瘫、肾功能衰竭、呼吸衰竭而死亡，病死率可达22% -50%，甚至高达70%。因此，恶性疟的早期诊断对于及早实施有效的治疗方案，减少重症病例及死亡病例、防范“二代”病例的发生十分重要。
[0006]发热病人血检是全世界公认的和推行的发现传染源唯一可靠可行的办法，在疟疾检测中占有很重要的地位。镜检仍是诊断疟疾的金标准，但其敏感性低，费时费力，漏检率高，还需要有相当经验的检验人员才能做到正确诊断，尤其是在低原虫血症、混合感染，以及需要大样本人群现场检测时，临床应用受到许多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特异、快速、方便的恶性疟诊断技术。[0007]实时荧光定量PCR技术与传统的PCR技术相比具有特异性和敏感性更强、自动化程度更高以及污染可能性更小等优点。
[0008]TaqMan实时荧光定量PCR技术依据目的基因设计合成了一条能够与之特异性杂交的探针，探针结合位置位于上下游引物之间，当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5’ 一 3’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上解离下来，破坏了两个荧光基团之间的突光共振能量转移(fluorescenceresonance energytransfer, FRET),而发出荧光，解离下来的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此根据反应体系中的荧光强度即可计算初始模板的数量。
[0009]恶性疟原虫的实时荧光定量PCR检测，包括两大步骤，首先是从标本中将恶性疟原虫核酸提取出来，然后再用实时荧光定量PCR技术对目的基因进行检测。疟原虫的裂殖子进入红细胞内发育增殖，被感染的红细胞最终被胀破，裂殖子、疟色素和其他代谢产物一起进入血流，引起一次临床发病。疟原虫检测标本,通常有两种,全血标本和滤纸干血片标本，后者由于便于现场采集、保存和运输，可以满足现场人群大规模筛查疟疾采样、特殊情况下(如在口岸现场)采样或在边远地区采样的需要，被广泛采用。
[0010]传统的疟原虫核酸分离方法，有水煮法、酚氯仿抽提法等。水煮法提取核酸有几种方式，一种是先用生理盐水或用双蒸水洗涤，然后用双蒸水煮沸裂解；一种是先用磷酸盐缓冲液洗涤，然后用双蒸水煮沸裂解；一种是先用皂素溶液裂解，然后用TriS-HCl溶液高温裂解。水煮法简捷、经济，但是核酸得率低、纯度低，不利于核酸的长期保存，并且核酸提取物中含有抑制核酸扩增反应的血红蛋白等物质，影响疟原虫检出率；商品化试剂盒提取核酸得率较高，在核酸扩增时受到的影响因素较少，但是试剂盒价格昂贵，不适合现场大量使用和边远穷困地区使用。
[0011]其它疟原虫核酸提取法有碘化钠法、酚氯仿抽提法等，这些方法耗时长、使用有毒试剂，对人体有害，污染环境，不适用于常规检测。
[0012]本发明的纳米磁分离疟原虫核酸提取法，可用于提取微量全血和滤纸干血片标本，利用经修饰的纳米磁微粒可以高效富集核酸特性，可获得高纯度的核酸模板，具有操作方便、快捷、高效，尤其在低水平疟原虫标本核酸提取时此纳米磁微粒高效捕获核酸特性，可以大大提闻痕原虫的检出率。
[0013]纳米磁微粒(MNP)是一种优良的磁性分离介质，具有比表面积大，磁响应性强，可应用于生物大分子(如蛋白质、核酸等)的快速分离提取，尤其是其表面进行化学修饰或高分子化合物包裹后，分离提取效率可大为提高，并可实现自动化操作，成本也大为降低，具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0014]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速高效、灵敏度高、特异性好、操作方便、价格低廉的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒。
[0015]本发明还提供一种与该特异性强、灵敏度高的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测相关的核苷酸序列。
[0016]本发明实现目的的技术方案如下:
[0017]一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组分:纳米磁微粒、标本稀释液、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照；
[0018]所述的纳米磁微粒为用无水乙醇配制的纳米磁微粒溶液；
[0019]所述标本稀释液为磷酸盐缓冲液PBS ； [0020]所述裂解液为5M异硫氰酸胍溶液；
[0021]所述结合液为无水乙醇；
[0022]所述洗液为70%乙醇；
[0023]所述洗脱液为ΤΕρΗ8.0 ；
[0024]所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针Pl，见序列3 ；
[0025]所述的质粒标准品为含有恶性疟原虫基因片段⑶的质粒；
[0026]所述的阳性对照为恶性疟原虫质粒标准品；
[0027]所述的阴性对照为正常人全血核酸提取液。
[0028]而且，疟疾疑似病例全血标本通常有两种形式，一种是抗凝全血标本，包括静脉全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、无名指或食指，抗凝剂采用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠，置于2-8°C或-20°C保存，供核酸提取用；一种是滤纸干血片标本，取疑似病例末梢血滴于灭菌的滤纸上，室温晾干后放入塑料袋密封，置于常温18-25°C或2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用。
[0029]而且，所述Fe3O4纳米磁微粒分离提取全血标本和滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA的步骤分述如下:
[0030]所述纳米磁微粒MNP分离提取全血标本中恶性疟原虫DNA的步骤为:
[0031]⑴在1.5mL离心管中加入裂解液150 μ L，加入恶性疟疑似病人全血标本50 μ L，标本量不足50 μ L时,用标本稀释液补足,润旋或颠倒混匀，56°C IOmin ；
[0032](2)加入200 μ L结合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，涡旋或颠倒混匀，室温静置lOmin，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；
[0033]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
[0034]⑷加入50 μ L洗脱液，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸
取上清液备用。
[0035]而且，所述纳米磁微粒MNP分离提取全血滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA的步骤为:
[0036]⑴将自然晾干的全血滤纸干血片标本，约Icm2大小，血量约为15-30 μ L，剪成纸条，放入1.5mL离心管中，向其中加入100 μ L的标本稀释液，加入裂解液150 μ L，涡旋或颠倒混匀，56°C IOmin ;8000rpm离心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL离心管中；
[0037](2)在上述装有上清液的离心管中，加入200 μ L结合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,涡旋或颠倒混匀，室温静置IOmin,用磁铁吸附MNP,弃上清；
[0038]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
[0039]⑷加入50 μ L洗脱液，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
[0040]一组恶性疟原虫实时荧光定量PCR检测用核苷酸序列，其核苷酸序列为序列1、序列2、序列3，其中序列I为上游引物、序列2为下游引物、序列3为荧光探针。
[0041]而且，所述上游引物、下游引物、荧光探针的浓度为:上游引物200nM，下游引物200nM，荧光探针120nM。
[0042]本发明的优点和积极效果如下:
[0043]1、本试剂盒将纳米磁分离提取全血标本和滤纸干血片标本核酸技术与实时荧光定量PCR技术进行有机结合，在标本核酸提取方面具有操作方便、快捷、价廉、高效的特点，尤其在提取微量疟原虫核酸方面具有很大优势，实现了最大程度降低漏检率的目标，本试剂盒的检测限可以达到25copies/ μ L。
[0044]2、本发明首次采取了纳米磁微粒分离提取全血标本和全血滤纸干血片标本疟原虫核酸的方法，可以最大程度地减少提取过程中疟原虫核酸的损失，快速高效地分离纯化全血标本和滤纸干血片标本中的恶性疟原虫DNA，再通过自主设计的实时荧光PCR检测体系对恶性疟原虫进行检测，通过构建质粒标准品，建立实时荧光PCR标准曲线，实现对恶性疟原虫的定量检测。
[0045]3、本发明选取恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)基因组18SrRNA保守区基因序列，设计特异性引物及荧光探针进行靶序列扩增，扩增片段长度为162bp。标本模板进行实时荧光PCR扩增，再利用质粒标准品构建的标准曲线，定量推算标本中的恶性疟原虫DNA水平。实例检测结果表明，本发明的方法可用于恶性疟原虫感染的诊断及其恶性疟原虫型别的鉴定。
[0046]4、本发明中疟原虫滤纸干血片标本由于现场采集、保存和运输方便，可以满足现场人群大规模筛查疟疾采样、或在边远地区采样的需要，被广泛采用，但是，从滤纸干血片中提取疟原虫核酸的方法多采用传统方法(水煮法、酚氯仿抽提法等)或者商品试剂盒法，前者核酸得率低、纯度低，提取液中含有抑制核酸扩增反应的抑制物，降低了疟原虫的检出率，后者价格昂贵，不适合现场大量使用和边远穷困地区使用。本发明提取疟原虫核酸，操作简单、快捷，价廉，核酸纯度高，经表面修饰的纳米磁微粒可高效捕获核酸，大大提高了疟原虫的检出率。
[0047]5、本发明应用纳米磁微粒分离提取全血标本和滤纸干血片标本疟原虫核酸和实时荧光定量PCR方法，解决了短时间内快速高效提取疟原虫核酸并对其准确定量检测的方法学问题，实验结果显示，根据本发明方法生产的产品灵敏度达到25c0pies/y I。恶性疟原虫完成一代红内期裂体增殖的时间不规则，一般为36-48小时。恶性疟原虫早期滋养体在血液中发育，逐渐隐匿在微血管等处，继发成晚期滋养体和裂殖体，一般在外周血液中不易见到。恶性疟原虫在发作期易于检测到阳性结果，在其它期阳性率较低。疟疾初发时原虫血症较低，需在48-72小时内反复涂血片镜检，必要时做骨髓涂片，以提高阳性率。由于疟原虫耐药株的产生以及不规范治疗等因素的影响，常会出现外周血疟原虫感染密度低或原虫形态不典型的情况，一定程度上影响了血液镜检阳性率和虫种的有效鉴定。2008年四川省疟疾实验室诊断的占65.7%，其余为临床诊断，而实验室诊断中有18.1%未进行疟原虫分型。2009年全 国30个省(市、区)共报告疟疾病例数14140例，其中间日疟占75.6%，恶性疟占7.4 %，未分型疟占17.0 %。2011年全国实验室未确诊病例比例^ 18.3% (821/4479)，其中共7个省(市、区)报告的实验室未确诊病例的比例高于25%。本发明提供的试剂盒可以敏感地检测出恶性疟原虫感染初期病例或外周血恶性疟原虫密度低的感染者，可以为低水平恶性疟原虫的感染提供快速确诊。
[0048]6、本试剂盒在开发过程中参考GeneBank中恶性疟原虫基因组18SrRNA保守区基因序列，设计得到了荧光定量PCR引物与探针，并应用于恶性疟原虫检测和定量分析，减少和避免了检测结果的假阴性或假阳性，提高了检测方法的准确性，同时该探针对恶性疟原虫种特异性非常好，如果确定阳性，可以确诊是恶性疟，使治疗更有针对性，根治更加彻底，防止复发；使用本试剂盒在入境归国人员中检测到极低水平的恶性疟原虫感染者，检测灵敏度非常高。
【专利附图】
【附图说明】:
[0049]图1显示的是标准曲线，质粒标准品拷贝数在2.5 X 10L2.5 X IO8Copies/μ L时，Ct值范围是11.91-36.45，质粒拷贝数的对数值与Ct值之间呈现良好的对数线性关系。实时荧光定量PCR反应体系标准曲线斜率为-3.43，截距为40.93，R2 = 0.999。 [0050]图2显示强、中、弱三个阳性标本实时荧光PCR扩增曲线；三个标本的Ct值分别是20.60,29.62,35.84，经标准曲线推算其恶性疟原虫水平分别为，8.46 X IO5Copies/μ L、2.00X 103copies/y L,30copies/y L ;反应曲线为典型的实时荧光PCR扩增曲线，均能够判定为阳性。
[0051]图3显示方法特异性曲线，从荧光扩增曲线上可以看到，恶性疟原虫出现了明显的扩增曲线，Ct值为25.30，而间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫以及阴性对照的扩增曲线均没有上升。
[0052]图4显示13份从非洲高疫区回国的入境人员标本检测曲线，其中1份标本Ct值为37.02，判断为恶性疟原虫可疑阳性，经复测最终判断为恶性疟原虫阳性。
【具体实施方式】
[0053]下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0054]本实施例使用的所有溶剂及试剂均为市售成品，引物及探针为委托基因公司合成，纳米磁微粒由北京出入境检验检疫局、国家纳米科学中心联合研制。
[0055]本发明除了采用纳米磁微粒分离疟原虫DNA以外，还可以采用常规技术分离疟原虫DNA，然后根据本发明提供的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和荧光探针(Pl)来检测恶性疟原虫，具体方法为本领域常规分离疟原虫DNA的方法，不再赘述。但是，在恶性疟原虫密度较低时，使用常规技术分离恶性疟原虫，漏检率会增高。
[0056]本发明关于实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中恶性疟原虫的试剂盒，该试剂盒组成包括:(I)分别装纳米磁分离核酸体系、水(超纯水)、实时荧光PCR反应体系、阴性对照、阳性对照和质粒标准品并加盖密封的多个试剂瓶或离心管；(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或离心管的包装盒。
[0057]本发明中涉及的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，包括实时荧光PCR检测的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和荧光探针(P1)，以及质粒标准品序列(S)，其具体序列如下:
[0058]Fl:5’ -TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTA-3’
[0059]Rl:5’ -GAACTCAATCATGACTACCCGTCTGT-3’
[0060]Pl:5’ -TCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGT-3’，
[0061]其中探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，或其他配对的荧光标记均可。
[0062]质粒标准品序列⑶如下:
[0063]TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTTTTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTC。
[0064]本发明提供的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，组成如下:
[0065]所述纳米磁微粒(简称MNP)为表面修饰的纳米磁性粒子，其制备过程为:首先利用热分解法分解乙酰丙酮铁(Ferric acetylacetonate),合成Fe3O4纳米粒子,在碱性条件下水解四乙氧基硅烷(Tetraethylorthosilicate,TEOS),包裹Fe3O4纳米粒子,形成表面为硅羟基的纳米磁性微粒。
[0066]纳米磁微粒具 体制备方法为:在三口烧瓶中将0.500g乙酰丙酮铁溶解于20mL苯甲醇，室温抽真空，再在氩气保护下以平均6.50C /min升温速率升至190°C，并在此温度下反应2h，得到黑色的胶体溶液。使用磁铁收集产物，用正己烷和乙醇分别洗涤数次，在真空干燥箱内抽真空，70°C干燥24h，即可制成四氧化三铁纳米磁微粒；将IOOmg四氧化三铁纳米磁微粒溶解在IOOmL乙醇水的混合溶液中，乙醇与水的体积比为4:1，再加入0.4mLTE0S、4mL氨水(浓度为25% )，TEOS经水解、聚合，最后经无水乙醇洗涤、抽滤、干燥即可制成表面为硅羟基修饰的纳米磁微粒。纳米磁微粒保存在无水乙醇中或者DEPC处理的水中，室温保存或者2-8 °C冷藏保存均可。
[0067]所述裂解液为:5M异硫氰酸胍、50mMTris-HCl、20mMEDTA、l% TritonX-100，调节pH值至6.0。
[0068]所述标本稀释液为磷酸盐缓冲液；
[0069]所述结合液为无水乙醇；
[0070]所述洗液为70%乙醇；
[0071 ] 所述洗脱液为TE (ρΗ8.0)；
[0072]所述实时荧光PCR反应液为PremixExTaq酶、上游引物(Fl)和下游引物(Rl)、荧光探针(Pl)、标本DNA |吴板和水；
[0073]质粒标准品为含有恶性痕原虫基因片段⑶的质粒，浓度为I X IO7Copies/μ L ;
[0074]所述的阳性对照为质粒浓度为I X IO3Copies/ μ L的质粒标准品；
[0075]所述的阴性对照为正常人全血标本核酸提取液。
[0076]具体操作方法如下:
[0077]1、质粒标准品构建步骤如下:
[0078]分离提取恶性疟原虫DNA，普通PCR反应扩增目的基因片段⑶；
[0079]对扩增片段进行切胶回收、连接、转化、筛选阳性克隆、测序，确认插入目的序列片段的准确性；[0080]纯化质粒,测定并计算质粒浓度；此次制备质粒浓度为2.5 X IO8Copies/ μ L ；
[0081]对质粒标准品进行10倍梯度稀释，质粒浓度为2.5X108、2.5X107、2.5X IO6,2.5Χ105、2.5Χ104、2.5Χ103、2.5Χ102 和 2.5X IO1Copies/μ L，Ct 值依次为 11.91,15.88、18.96,22.72,25.90,28.96,32.45,36.45，检测灵敏度为 25copies/μ L。选定合适的质粒标准品浓度范围(2.5 X IO1Copies/ μ L~2.5 X IO8Copies/ μ L)，以实时荧光PCR的Ct值为纵坐标(y)，以恶性疟原虫核酸拷贝数的对数值为横坐标(X)，构建标准曲线。
[0082]上述的普通PCR反应液为:10 X PCRbuffer (含Mg2+)、上游引物(Fl)、下游引物(Rl)、Taq酶、dNTPs、模板(恶性疟原虫DNA)和水。
[0083]普通PCR反应步骤:在0.2mL离心管中，依次加入2.5 μ LlO X PCRbuffer (含Mg2+)，
0.5 μ LdNTPs (IOmM)，上游引物(FLlOyM)和下游引物(RLlOyM)各 I μ L，0.2 μ LTaq 酶(5~4 1^)、2 4 1^恶性疟原虫0嫩提取液，补水至25“1^反应条件为:95°C lmin ；95°C 30s,55°C 30s, 72°C 40s，35 个循环；72°C lOmin，4°C保存备用。
[0084]2、纳米磁微粒(MNP)分离提取全血标本中恶性疟原虫DNA步骤如下:
[0085]⑴在1.5mL离心管中加入裂解液150 μ L,加入恶性疟疑似病人全血标本50 μ L,标本量不足50 μ L时,用标本稀释液补足,润旋或颠倒混匀，56°C IOmin ；
[0086](2)加入200 μ L结合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/μ L)，涡旋或颠倒混匀，室温静置lOmin，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；
[0087]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
[0088]⑷加入洗脱液50 μ L，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸
取上清液备用。
[0089]3、纳米磁微粒(MNP)分离提取全血滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA步骤如下:
[0090]⑴将自然晾干的全血滤纸干血片标本，剪成纸条(剪刀在剪切前后均在酒精灯上烧一下)，放入1.5mL离心管中，向其中加入100 μ L的标本稀释液，加入裂解液150 μ L，涡旋或颠倒混匀，56°C IOmin ;8000rpm离心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL离心管中；
[0091](2)在上述装有上清液的离心管中，加入200 μ L结合液,加入20 μ LMNP(25 μ g/μ L),涡旋或颠倒混匀，室温静置IOmin,用磁铁吸附MNP,弃上清；
[0092]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
[0093]⑷加入洗脱液50 μ L，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
[0094]4、实时荧光PCR:
[0095]在0.2mL 离心管中，依次加入 12.5 μ L2 X PremixExTaq, 0.5 μ L 上游引物(Fl，10μΜ)、0.5yL下游引物(R1，10 μ M)，0.3 μ L荧光探针(Ρ1，10 μ Μ)、2 μ L上述恶性疟原虫DNA提取液，补水至25 μ L0如采用ΑΒΙ7900实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，则使用实时数据采集模式，数据采集分析系统为SDS2.3。
[0096]循环反应参数为95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s,40 个循环。
[0097]5、反应系统的质量控制:
[0098]根据使用不同的实时突光PCR仪设定好基线(baseline),设定的一般原则以阈值线刚好超过正常阴性对照反应曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。反应结果应同时符合以下2个条件:即阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct〈35并有明显扩增曲线。否则，试验结果无效。
[0099]阴性结果:样品无Ct值或Ct > 40，且无明显扩增曲线，报告为恶性疟原虫实时荧光PCR检测结果为阴性。
[0100]阳性结果:样品Ct值≤35，并有明显扩增曲线，报告为恶性疟原虫实时荧光PCR检测结果为阳性。
[0101]可疑结果:样品Ct值在35-40之间的标本必须重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该标本判断为恶性疟原虫实时荧光PCR检测结果为阳性，否则为阴性。
[0102]值得特别 说明的是，为了实现本发明的恶性疟原虫定量检测，参考GeneBank中恶性疟原虫基因组18SrRNA保守区基因序列，利用DNAMAN6.0进行序列比对，通过软件PrimerExpress3.0设计实时突光PCR引物与探针。构建质粒标准品的上、下游引物为实时荧光PCR上、下游引物，质粒标准品基因片段为162bp。借助这些质粒标准品制作外标定量标准曲线，以实现恶性疟原虫的定量检测。
[0103]具体检测实例
[0104]实施例1:恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及其使用
[0105]⑴制备包括下列组成成分的试剂盒:
[0106]纳米磁微粒、标本稀释液、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、实时荧光PCR反应液、超纯水、阴性对照、阳性对照、质粒标准品。
[0107]⑵标本采集、运送和保存:
[0108]全血标本:无菌操作采集疑似恶性疟病人的全血标本；全血标本，包括静脉全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、无名指或食指；抗凝剂可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠；一周内进行疟原虫检测的可存放于2-8°C，长时间保存应置于_20°C或_70°C以下；标本运送应符合生物安全要求，在冷藏(2-8°C )或冷冻(_20°C )的条件下运送。
[0109]滤纸干血片标本:取疑似病例末梢血滴于灭菌的滤纸片上，室温自然晾干后放入塑料袋密封，置于常温(18-25°C )或冷藏或冷冻保存；标本可在常温、冷藏或者冷冻的条件下运送。
[0110]⑶检测步骤和结果分析:
[0111]全血标本中的恶性疟原虫核酸分离提取:在1.5mL离心管中加入裂解液150 μ L，加入恶性痕疑似病人全血标本50 μ L,标本量不足50 μ L时,用标本稀释液补足,润旋或颠倒混匀，56°C IOmin ;加入200 μ L结合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，涡旋或颠倒混匀，室温静置lOmin，用磁铁吸附MNP，弃上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；加入洗脱液50 μ L，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
[0112]阴性对照全血与病人全血标本提取核酸步骤相同。
[0113]滤纸干血片标本中的恶性疟原虫核酸分离提取:
[0114]将自然晾干的全血滤纸干血片标本，剪成纸条(剪刀在剪切前后均在酒精灯上烧一下)，放入1.5mL 离心管中，向其中加入100 μ L的标本稀释液，加入裂解液150 μ L，涡旋或颠倒混匀，56°C IOmin ;8000rpm离心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL离心管中；在上清液中加入200 μ L结合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，涡旋或颠倒混匀，室温静置lOmin，用磁铁吸附MNP，弃上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；加入洗脱液50 μ LjfMNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
[0115]实时荧光PCR:分别取2 μ L上述恶性疟原虫DNA提取液、或2 μ L阳性对照或阴性对照或系列梯度稀释的质粒标准品，加入实时荧光PCR反应管中，反应总体积为25 μ L，其中上游引物(Fl)200nM，下游引物(Rl) 200nM，荧光探针(Pl) 120nM。采用ABI7900实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，使用实时数据采集模式，数据采集分析系统为SDS2.3。
[0116]循环反应参数为95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s,40 个循环。
[0117]反应结束后保存检测数据文件，并对数据文件进行分析。
[0118]由图2可见强、中和弱三个阳性标本的扩增曲线，三个标本的Ct值分别是20.60,29.62,35.84，经标准曲线推算其恶性疟原虫水平分别为8.46X IO5Copies/μ L、2.0OX IO3Copies/ μ L,30copies/ μ L ;反应曲线为典型的实时荧光扩增曲线，均能够判定为阳性。
[0119]图3显示该检测方法的特异性曲线。恶性疟原虫标本检测Ct值为25.30，根据标准曲线推算出标本中恶性疟原虫含量，为3.60 X IO4Copies/μ L ;而间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫以及阴性对照的扩增曲线均没有上升。
[0120]图4显示采用本试剂盒，对非洲流行区回国的入境人员的恶性疟原虫感染状况进行检测，结果检测出I例低水平恶性疟原虫感染者，Ct值为37.02，判断为恶性疟原虫可疑阳性，经复测验证最终判断为恶性疟原虫阳性，恶性疟原虫水平为Hcopies/μ L。对此例感染者进行随访，发现其4天前在非洲疫区医院因疟疾治愈而出院；此次入境时检出其体内存在低水平的恶性疟原虫，说明该患者还没有完全治愈，还有恶性疟复燃的危险，建议其及早行疟疾根治治疗；病人随后及时到专科医院就医，经抗恶性疟治疗康复。
【权利要求】
1.一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括如下组分:纳米磁微粒、标本稀释液、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照； 所述的纳米磁微粒为用无水乙醇配制的纳米磁微粒溶液； 所述标本稀释液为磷酸盐缓冲液PBS ； 所述裂解液为5M异硫氰酸胍溶液； 所述结合液为无水乙醇； 所述洗液为70%乙醇； 所述洗脱液为TEpH8.0 ； 所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针Pl，见序列3 ； 所述的质粒标准品为含有恶性疟原虫基因片段(S)的质粒； 所述的阳性对照为恶性疟原虫质粒标准品； 所述的阴性对照为正 常人全血核酸提取液。
2.根据权利要求1所述的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:疟疾疑似病例全血标本通常有两种形式，一种是抗凝全血标本，包括静脉全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、无名指或食指，抗凝剂采用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠，置于2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用；一种是滤纸干血片标本，取疑似病例末梢血滴于灭菌的滤纸上，室温晾干后放入塑料袋密封，置于常温18-25°C或2-8°C或-20C保存，供核酸提取用。
3.根据权利要求1所述的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述Fe3O4纳米磁微粒分离提取全血标本和滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA的步骤分述如下: 所述纳米磁微粒MNP分离提取全血标本中恶性疟原虫DNA的步骤为: (1)在1.5mL离心管中加入裂解液150 μ L，加入恶性疟疑似病人全血标本50 μ L，标本量不足50 μ L时,用标本稀释液补足,润旋或颠倒混匀，56°C IOmin ； ⑵加入200 μ L结合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，涡旋或颠倒混匀，室温静置IOmin,用磁铁吸附MNP，弃上清； ⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁铁吸附ΜΝΡ，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液； ⑷加入50 μ L洗脱液，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
4.根据权利要求3所述的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述纳米磁微粒MNP分离提取全血滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA的步骤为: ⑴将自然晾干的全血滤纸干血片标本，约Icm2大小，血量约为15-30 μ L，剪成纸条，放入1.5mL离心管中，向其中加入100 μ L的标本稀释液，加入裂解液150 μ L，涡旋或颠倒混匀,56。。IOmin ;8000rpm离心Imin,吸取上清液于另一支1.5mL离心管中； (2)在上述装有上清液的离心管中，加入200μ L结合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,涡旋或颠倒混匀，室温静置IOmin,用磁铁吸附MNP,弃上清；⑶ 加入300 μ L洗液清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液； ⑷加入50 μ L洗脱液，将MNP吹打混匀，56°C 5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
5.一组恶性疟原虫实时荧光定量PCR检测用核苷酸序列，其特征在于:其核苷酸序列为序列1、序列2、序列3，其中序列I为上游引物、序列2为下游引物、序列3为荧光探针。
6.根据权利要求5所述的一组恶性疟原虫实时荧光定量PCR检测用核苷酸序列，其特征在于:所述上游引物、下游引物、荧光探针的浓度为:上游引物200nM，下游引物200nM，荧光探针120nM。
【文档编号】C12N15/11GK103937907SQ201410201466
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】刘翌, 王飞, 田茵, 孙宁, 杨静, 孙福军, 刘艳华, 薛强, 高璟瑜, 张绍福, 邹明强, 邓丛良, 葛广路 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局