脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种将脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的神经细胞。
【专利说明】脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及神经生物学领域，特别涉及一种将脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。
【背景技术】
[0002]脐带间充质干细胞(MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软骨和脂肪三种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现MSC在中胚层之外，还可以跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞以及内胚层系的肝细胞和胰腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细胞所面临的伦理学问题，这使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征以及外部创伤造成的神经损伤等长期困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。
[0003]过去几年来，国内外许多研究小组报道了体外将MSC定向诱导分化为神经元、胶质细胞的方法。
[0004]MSC定向诱导分化为神经细胞的实验研究有少数国外研究机构正在进行，而国内研究很少，而且现有报道的诱导分化方法诱导周期长，得到的神经细胞分化效率低、细胞分化均一度低。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种在体外将人脐带间充质干细胞诱导培养分化成神经细胞的新方法，同时制备得到分化的神经细胞。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0007](I)、脐带间充质干细胞的培养和扩增:获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5X 105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；
[0008]所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2% B27，2-4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油(MTG)，I % 非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml, bFGF20_30ng/ml，80_90U/ml 青霉素，60-70 μ g/ml 链霉素；
[0009](2)、预诱导分化:将步骤⑴得到的细胞按I~5X 104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导；
[0010]所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol~50nmol的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，l-8mML-谷氨酰胺，2_5mM硫代甘油(MTG)，80-100U/ml 青霉素，80-100 μ g/ml 链霉素；
[0011]步骤(3)诱导分化:将步骤(2)得到的细胞按I~5 X 104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；
[0012]所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol~50nmol的维生素 C，30nmol ~40nmol 的维生素 BI，0.01-0.02%的01^0，0.1πιΜ2-β-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，l_8mML-谷氨酰胺，2-5mM 硫代甘油(MTG)，80-100U/ml 青霉素，80-100 μ g/ml 链霉素。
[0013]本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不仅限于:DMEM，DMEM/F12，2% B27。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。
[0014]作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。他们可以包括但不限于:氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。
[0015]本发明所用的所有试剂均可通过商业途径购买得到。
[0016]本发明所述方法获得的神经细胞至少具有如下特征之一:
[0017](a)具有典型的细胞体、轴突和树突等细胞结构；
[0018](b)至少表达蛋白:β -tublin III ；
[0019](c)神经细胞占诱导细胞群体86-91%左右； [0020](d)对外界刺激具有放电功能。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:相比现有技术中一步诱导神经细胞的方法，本发明采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，采用该诱导方式，诱导周期短6~10天、细胞分化均一度高(比例高达90%以上)，明显高于目前现有技术中神经细胞的诱导效率，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能。
[0022]本发明的二步诱导法和使用的优化培养液的组合未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明神经细胞的免疫细胞化学结果，A为本发明神经细胞β -tublin III免疫细胞化学结果，B为相差图；
[0024]图2为实施例2诱导的神经细胞的流式细胞分析，B为本发明神经细胞，A为同型对照；
[0025]图3为实施例3诱导的神经细胞的流式细胞分析，B为本发明神经细胞，A为同型对照；
[0026]图4为实施例2诱导的神经细胞的电生理检测；
[0027]图5为实施例3诱导的神经细胞的电生理检测。
【具体实施方式】
[0028]实施例1、脐带间充质干细胞获取和培养
[0029]使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。[0030]将新生儿脐带在含I %双抗的生理盐水中洗涤三次，去除表面的血污，然后剪成约I厘米长的小段。用眼科剪将脐带沿血管平行方向纵向剖开，将2根脐动脉和I根脐静脉血管从脐带中剥离干净。剥掉表面羊膜，华通胶部分用含I %双抗的生理盐水充分洗涤3次，剪碎至约Imm3大小。将剪碎的组织块均匀的平铺在75cm2培养瓶内，室温放置5_10min，使组织块贴紧。加入5ml培养基，培养基含DMEM/F12，2% B27,4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油(MTG)，I %非必需氨基酸，EGF20ng/ml, bFGF20ng/ml, 90U/ml 青霉素，70 μ g/ml 链霉素，37°C 5% CO2孵箱培养。每隔三天更换一次培养基，细胞生长至铺满培养皿后传代培养。
[0031]也可以使用市售或商售的合法来源的脐带间充质干细胞通过实施例1的方法直接进行培养。
[0032]实施例2、脐带间充质干细胞体外定向诱导分化I
[0033]新鲜传代的P3-6代脐带间充质干细胞以5X 104/ml接种于放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔板内，Iml/孔，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3天时终止诱导。
[0034]预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，80U/ml青霉素，80 μ g/ml链霉素。
[0035]将预诱导培养得到的细胞按5X 104/ml的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3天时终止诱导，得到神经细胞；
[0036]诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0.01 %的DMS0，0.lmM2_β -巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，100U/ml青霉素，80 μ g/ml链霉素。
[0037]对实施例2中诱导得到的脐带间充质干细胞的免疫细胞化学结果、流式细胞分析结果和电生理检测结果，结果表明诱导培养即诱导产生了神经细胞，而且细胞分化比例达到91.43%，而且得到的神经细胞对外界刺激具有放电功能。
[0038]实施例3、脐带间充质干细胞体外定向诱导分化2
[0039]新鲜传代的P3-6代脐带间充质干细胞以5X 104/ml接种于放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔板内，Iml/孔，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第4天时终止诱导。
[0040]预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，此基础上还含有20nmol的维生素C，IOU/ml人白细胞抑制因子，ImM L-谷氨酰胺，2mM硫代甘油(MTG)，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链
霉素O
[0041]将预诱导培养得到的细胞按5X 104/ml的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第6天时终止诱导，得到神经细胞；
[0042] 诱导培养液为DMEM作为基础培养基，此基础上还含有20nmol的维生素C，40nmol的维生素BI，0.02%的DMS0，0.lmM2- β -巯基乙醇，20U/ml人白细胞抑制因子，10U/ml碱性成纤维细胞生长因子，ImM L-谷氨酰胺，2mM硫代甘油(MTG)，80U/ml青霉素，80 μ g/ml链霉素。
[0043]对实施例3中诱导得到的神经细胞进行免疫细胞化学、流式细胞分析和电生理检测，结果表明诱导产生了神经细胞，而且细胞分化比例达到86.64%，而且得到的神经细胞对外界刺激具有放电功能。
[0044]实施例4对比实施例
[0045]新鲜传代的P3-5代脐带间充质干细胞以5X 104/ml接种于放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔板内，Iml/孔，贴壁培养3天后更换培养液为DMEM/F12，2% B27此基础上还含有8mM L-谷氨酰胺，80U/ml青霉素，80 μ g/ml链霉素。3天后半量换液，第6天时终止诱导。
[0046]实施例5神经细胞的检测
[0047](I)免疫组化鉴定
[0048]步骤:(I)将实施例2方法获得的神经细胞加入4ml预热至30°C，用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)漂洗细胞两次，每次4min ;(2)加入2mi3%多聚甲醛固定液，室温固定20min ; (3)DPBS漂洗4次，每次2min。用含1% Triton X-100的DPBS在35°C温育20分钟。(4)加入2ml含6%山羊血清的DPBS，室温下作用20min。(5)用枪头吸弃封闭液后，加入I: 500稀释的鼠抗人β-tublin III单抗，4°C过夜。(6)用枪头吸弃一抗反应液，用DPBS漂洗4次，每次3min。(7)加入1: 200稀释的羊抗鼠荧光二抗，37°C避光温育lh。(8)用枪头吸弃第二抗体反应液后，用DPBS漂洗两次，每次4min。(9)双蒸水漂洗3次，荧光显微镜(Nikon)下观察并拍照记录，如图1显示，A实施例2诱导的神经细胞β -tublin III免疫细胞化学结果，B为相差图。结果表 明成功诱导产生了神经细胞。
[0049]将实施例3方法获得的神经细胞重复该方法，结果同样表明成功诱导产生了神经细胞。
[0050](2)流式细胞分析
[0051]步骤:(1)将实施例2-4方法诱导的神经细胞，分别以300Xg离心4min后用4°C DPBS漂洗两次。(2)重悬于0.5ml的4°C的4%多聚甲醛中，18°C温育10分钟。间歇地涡旋管子以维持单细胞悬液。(3) DPBS漂洗2次，每次2min。300 Xg离心4min。(4)用含1% Triton X-100的DPBS在37°C温育20分钟。(5) 300X g离心4min，弃上清后加入2ml含5%山羊血清的DPBS(封闭液)，室温下作用20min。(6)300Xg离心5min，弃上清后加入I: 50稀释的FITC标记过的β-tublin III单抗；加抗体稀释液作为同型对照。室温孵育2小时。(7) 300 Xg离心5min，弃上清，用DPBS漂洗3次，每次3min。(8) 300 Xg离心5min,弃上清后每管用200ul的DPBS重悬细胞，上流式细胞仪进行检测分析。图2中B显示实施例2诱导细胞中神经细胞比例约占91.43%,A图为实施例4对照。图3中B显示实施例3诱导细胞中神经细胞比例约占86.64%, A图为实施例4对照。
[0052](3)电生理检测
[0053]培养皿中的培养测试腔内加入150 μ I的10 μ g/ml多聚赖氨酸表面处理液，37°C培养箱中放置20小时，然后用灭菌双蒸水将培养皿漂洗4次，铺入实施例2获得的神经细胞，37°C、5%°C O2培养2天，再对神经细胞进行无镁细胞外液37°C处理4h。采用LAPS芯片系统检测诱导出的神经细胞电位，结果如图4-5所示。图4中显示实施例2得到的神经细胞经无镁诱导电位信号(上)及自发电位信号(下)，图5中显示实施例3得到的神经细胞经无镁诱导电位信号(上)及自发电位信号(下)，结果表明本发明培养得到的神经细胞对外界刺激具有放电功能。
[0054]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子， 还可以有许多变形。
【权利要求】
1.一种脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)、脐带间充质干细胞的培养和扩增:获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5 X 105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞； 所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2% B27，2-4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油，I %非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml, bFGF20-30ng/ml, 80-90U/ml 青霉素，60-70 μ g/ml 链霉素； (2)、预诱导分化:将步骤(1)得到的培养细胞按I~5X104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导； 所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol~50nmol的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，l_8mM L-谷氨酰胺，2_5mM硫代甘油，80_100U/ml青霉素，80-100 μ g/ml链霉素。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，其特征在于:还包括步骤(3)诱导分化:将步骤(2)得到的细胞按I~5X104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol~50nmol的维生素C, 30nmol~40nmol的维生素BI, 0.01-0.02 %的二甲基亚砜，0.1πιΜ2-β-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10_30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，l-8mM L-谷氨酰胺 ，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100 μ g/ml链霉素。
3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，其特征在于:所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2% B27,4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油，1%非必需氨基酸，EGF20ng/ml, bFGF20ng/ml90U/ml青霉素,70 μ g/ml链霉素；所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80 μ g/ml链霉素；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素BI，0.01%的二甲基亚砜，0.1πιΜ2-β-巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素。
4.根据权利要求1-3之一的方法培养得到的神经细胞。
【文档编号】C12N5/079GK104004713SQ201410201461
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】安沂华, 董健伸 申请人:安沂华