来自恶性疟原虫的p47(pfs47)或来自间日疟原虫的p47(pvs47)作为疫苗或药物筛选靶标 ...的制作方法
【专利说明】来自恶性疟原虫的P47(PFS47)或来自间日疟原虫的 P47(PVS47)作为疫苗或药物筛选靶标用于抑制人疟疾传 播的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求享有2012年8月17日提交的美国临时申请号61/684, 333的优先权 权益，其所有内容在此完整引入作为参考。
技术领域
[0003] 本发明包括用于递送疟原虫P47疫苗或P47抗体以预防恶性疟原虫（Plasmodium falciparum)或间日疱原虫（Plasmodium vivax)疱疾的方法和组合物。P47疫苗、抗体疫 苗或药物阻断或减少寄生虫在按蚊中的传播，从而使主要导致疟疾流行的媒介失效。
[0004] 发明背景
[0005] 人类疟疾由疟原虫寄生虫造成。根据疾控中心，疟疾是世界范围内最严重的公共 卫生问题之一。在许多发展中国家，它是死亡和疾病的主要原因，主要影响幼儿和孕妇。超 过30亿人（世界人口的一半）生活在具有疟疾传播风险的区域，分布于109个国家和地区。 35个国家（30个位于撒哈拉以南非洲，5个位于亚洲）占据全球疟疾死亡数的98%。世界 卫生组织（WHO)估计在2008年，疟疾造成1. 90-3. 11亿临床发作和708, 000-1，003, 000例 死亡。世界范围内89%的疟疾死亡发生在非洲。疟疾是世界范围内传染性疾病的第五大流 行的死因（排在呼吸道感染、HIV/AIDS、痢疾疾病和结核之后）。在非洲，疟疾是传染性疾 病的第二主要死因，排在HIV/AIDS之后。
[0006] 在撒哈拉以南非洲的大量区域，蚊子闪比亚按蚊（Anopheles gambiae)是恶性疱 原虫疟疾的主要媒介。当蚊子从被感染的人吸取血液时，它就被感染，并且寄生虫需要在蚊 子中经历复杂的发育周期以传播至其他人。来自动物模型的研宄表明，蚊子通过建立免疫 应答（其能够大大限制疟原虫存活）能够自我防护。因此，还不清楚为什么疾病传播在高 度流行区域如此有效。在世界上已经消灭疟疾的所有区域中，这是通过控制蚊子媒介的群 体实现的，并且降低疾病传播率被认为是消灭流行区域疟疾的关键步骤。
[0007] 目前，没有FDA批准的用于疟疾的疫苗，并且对现有抗疟疾药物的抗性也在增加。 现有的用于疟疾传染的疗法包括氯喹、硫酸奎宁、羟氯奎、甲氟喹、强力霉素和青蒿素。氯喹 抗性是公知的；已经报道了对青蒿素的抗性。传播阻断疫苗将降低疾病载荷，从而提高现有 疗法的有效性。
[0008] 已经和正在恶性疟原虫配子表面蛋白领域进行研宄，目标通常是为了鉴定疟疾疫 苗候选物。在其生命周期中，恶性疟原虫在蚊子和人宿主之间交替。当被感染的蚊子吸取 血餐时，寄生虫子孢子感染人宿主的肝，增殖并定殖于红细胞（RBC)，在那里它们继续增殖 并且其中一些发育为配子母细胞。当蚊子下一次血餐吸取到RBC时，配子母细胞作为配子 离开RBC进入蚊子中肠。接着发生受精以形成合子，其及时发育为能动的动合子。动合子 转化为卵囊，该阶段寄生虫增殖并释放数以千计的子孢子，其迀移到蚊子唾液腺，当被感染 的蚊子吸取血餐时将感染新的人。
[0009] 性阶段特异性的表面抗原是疫苗候选物的目标，因为破坏这些抗原将降低生育 力，从而降低寄生虫的感染性。在Eksi, S.等人（2006)Molec. Microbiol. 61 (4) :991-998 中，发现在雄配子表面找到的Pfs230抗原具有性阶段同源物Pfs48/45和Pfs47。关注到 Pfs230是一种重要的疫苗候选物，因为其在RBC相互作用和卵囊产生中起作用。测定Pfs47 作为Pf s48/45的结构模拟物与完整Pf s230 Λ 1大配子表面的反应性。在GerIoff，DL等人 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (38) : 13598-13603 中，Pfs230 被鉴定为疟原虫 10 成员家 族的最大蛋白，其特征在于富含半胱氨酸的双结构域，每一半具有1-3个二硫键。由于它们 在配子上的表面定位，Pfs230、Pfs 48/45、Pfs4等等被描述为潜在的传播阻断疫苗。
[0010] 在 Anthony, TG 等人（2007)Mol. Biochem. Parasitol. 156(2) :117-23 中，观 察到Pf s47和fs48/45的序列非同义多态性，表明对生育力具有功能重要性。在van Schai jk, BCL 等人（2006)Molec.Biochem.Parasitologyl49(2) :216-222 中，讨论了 Pfs48/45和Pfs230作为候选疫苗的重要性，因为它们定位于配子表面。同源物Pfs47,尽 管在雌配子上表达，根据敲除和单克隆抗体实验，显示对生育力来说不重要。具体来说，当 向包含野生型寄生虫的血餐中添加抗Pfs47的3种单克隆抗体时，它们不能抑制斯氏按蚊 (Anopheles Stephens)的感染。作者总结得出，Pfs47不可能是疫苗候选物。
[0011] 还进行研宄以确定一些疟原虫寄生虫逃避蚊子免疫系统的机制。已经报道称对一 些恶性疟原虫品系感染抗性的蚊子可以黑化（melanize)其他品系。具体来说，闪比亚按蚊 L3-5抗性品系黑化巴西恶性疟原虫7G8品系，但不黑化非洲恶性疟原虫3D7、NF54和GB4 株。对寄生虫感染相同抗性品系能力的这种差异的研宄表明，包含硫酯的蛋白I(TEPl)在 蚊子抑制疟原虫传播的能力中起作用（Molina-Cruz (2012)PNAS 109(28) :E1957 -E1962)。
[0012] 发明概述
[0013] 恶性疟原虫具有数种分离株，包括在非洲、美国和亚洲发现的。这些株的每一种表 达稍微不同形式的Pfs47蛋白。本发明包括认识到Pfs47允许寄生虫抑制或逃避免疫系统 从而确保寄生虫存活的。Pfs47的进化提供非常强大的机制，通过该机制允许恶性疟原虫在 野外的有效传播。
[0014] 尽管已知编码Pf s47的基因，但之前并未了解Pf s47通过操纵蚊子免疫系统使寄 生虫存活的事实。因为现在已经发现这种联系，所以有可能开发新的疟疾疫苗和用于鉴定 其他的药剂的方法，所述药剂可以干扰Pfs47操纵蚊子免疫系统的能力。
[0015] 降低疟疾传播速率对于消灭该疾病来说是必不可少的。如本文所述，关于Pfs47 作为传播阻断靶标只有很少的支持。当将Pfs47抗体添加到用于野生型寄生虫的血餐时， 它们不能抑制蚊子感染（Schaijk等人（2006)，上文）。与现有技术已接受的观点相反，本 发明包括确认Pfs47实际上对于恶性疟原虫的野外传播非常关键。Pfs47和相关化合物作 为传播阻断靶标的新用途涉及蚊子免疫系统的主动参与。具体来说，将疫苗（包括Pfs47 或其抗体）或药剂（其抑制Pfs47)与蚊子接触可以阻止Pfs47与蚊子免疫系统相互作用 并操纵该系统。通过这类疫苗或药剂抑制或失活Pfs47,蚊子免疫系统能够"看见"寄生虫， 并将其摧毁或实质性降低。
[0016] 本发明还包括确认P47蛋白、它们的抗体以及被认为抑制P47的药剂可以有效作 为疟疾传播的疫苗或传播阻断剂。如本文所述，P47蛋白包括，但不限于，恶性疟原虫产生 的Pfs47和间日疟原虫产生的Pvs47。
[0017] 如实施例部分详述，使用闪比亚按蚊的抗性株（无法杀死恶性疟原虫非洲株GB4、 NF54和3D7,但非常有效的杀死恶性疟原虫巴西7G8株）鉴定Pfs47为负责恶性疟原虫有 效传播的蛋白。基于Pfs47在传播中的重要作用，事实证明通过各种方式破坏Pfs47的功 能可以是新的和有力的实质性控制和降低疟疾流行性的方式。
[0018] 因此，如下文详细所述，本发明的一个实施方案包括疫苗及其施用，其中所述疫苗 是包含P47蛋白（或其免疫片段或变体）的药物组合物；或包含针对P47蛋白（或其免疫 片段或变体）的抗体（或其片段）的药物组合物。
[0019] 在其他实施方案中，利用P47的关键作用来开发用于在野外破坏P47功能的新药 剂。在一个方面，用于鉴定新药剂的测定法包含在感染恶性疟原虫的蚊子中筛选候选化合 物。在另一个方面，测定法涉及在细胞中筛选候选化合物，所述细胞中JNK信号转导途径已 经被失活来鉴定可以恢复JNK信号转导的药剂。
[0020] 在其他实施方案中，本发明包括能够表达抗体或其他药剂（其可以破坏P47功能） 的转基因和副转基因（paratransgenic)蚊子。在副转基因蚊子中，已经将编码抗体或其他 药剂的基因插入定殖于肠微生物群的细菌的基因组中并表达和输出，从而所述药剂可以与 蚊子肠或其他器官中的P47相互作用。
[0021] 附图简述
[0022] 图1显示在抗性（R)蚊子中胃肠外和子代恶性疟原虫品系的存活，以及黑化表型 的数量性状基因座（QTL)作图。（A)R蚊子的中肠中的恶性疟原虫GB4和7G8寄生虫。（B) 在R蚊子中GB4x 7G8遗传杂交的胃肠外和子代品系的黑化表型。（C)黑化表型的基因组范 围QTL分析的奇数对数分数（LOD)。红色虚线，在P = 0. 05和P = 0. 40时的统计显著性阈 值；箭头，显著QTL。
[0023] 图2显示连锁群挑选、mRNA表达和编码区域序列分析。（A)在从S或R蚊子解剖的 单个卵囊中，纯合的非洲（AA ;水平线）巴西（BB ;垂直线）或杂合（AB，对角线虚线）标记物 沿着Chr. 13的基因型频率。（黑色箭头，R株中极端阴性选择中的BB区域）。（B)GB4/7G8 恶性疟原虫动合子阶段中候选基因的相对mRNA表达。深红色斑点，在GB4和7G8之间具有 非同义单核苷酸多态性（SNP)的基因；箭头，GB4-3D7和7G8-SL株之间共有的SNP。
[0024] 图3显示不同蚊子中NF54野生型（WT)或Pfs47敲除（KO)的表型。（A)R和S蚊 子中黑化（X轴）和活（y轴）KO寄生虫的数目。每个点表示单个中肠。中值用水平线表示。 (B) TEP-I沉默对R蚊子中KO感染的影响。（C)沉默TEP-I对S蚊子中WT和KO感染的影 响。（D)利用Pf s47和Pf s25对WT和KO动合子的免疫荧光染色（比例尺=5 μ m)。（E)用 WT或KO寄生虫感染（I =感染的）或饲喂未感染血液（C =对照）S雌蚊24h后，HPX2和 N0X5的中肠 mRNA表达，和使用ELISA的中肠硝化作用。
[0025] 图4显示利用巴西（7G8)和非洲（NF54)的Pfs47等位基因补充Pfs47敲除（KO) 寄生虫的效果。在闪比亚按蚊R株中用（A)NF54或（B)7G8Pfs47等位基因补充的Pfs47K0 寄生虫的感染性。
[0026] 图5显示，限定与恶性疟原虫（Pf)黑化表型有关的染色体13数量性状基因座 (QTL)的标记物的图示。Pf胃肠外（GB4等位基因，对角线；7G8等位基因，对角虚线）的微 卫星（MS)标记物基因型，和具有邻近最初QTL边界的重组位点的3个子代品系（KA6、DAN和 WE2)。已知的标记物（基于所述杂交的公开连锁图）用它们的名称表示（C13M63、C13M87 和TA56) (1)。新的MS标记物从基因组鉴定，并用于更准确的定位重组位点；它们的染色体 位置用Kb表示（顶行）。每个标记物等位基因的PCR产物大小用碱基对表示。用重组位点 标示的最终QTL边界（1773. 4Kb和945. 68Kb)用箭头（丨）指示，并限定一个172Kb区域。 用于基因分型的引物序列显示于表1。
[0027] 图6显示沿着单个卵囊的染色体13的基因型，所述卵囊解剖自易感性⑶G3或抗 性（R) L3-5冈比亚按蚊（用GB4非洲（A等位基因）和7G8巴西（B等位基因）恶性疟原虫 株之间杂交的未克隆（un-cloned)子代进行感染）的中肠。每个标记物的单个卵囊基因型 分别用不同的阴影模式表示：纯合的非洲（AA，采用对角线），纯合的巴西（BB，采用对角虚 线），和杂合的（AB，采用网格线）。每个标记物的基因型频率在每个表的底部显示。沿着染 色体13的26个标记物的染色体位置和引物显示于表2。QTL边界用箭头指示。
[0028] 图7显示50个额外单个卵囊的基因型，所述卵囊解剖自抗性L3-5冈比亚按蚊，其 用GB4非洲和7G8巴西恶性疟原虫株之间杂交的未克隆子代进行感染。在强遗传选择条件 下，在染色体13的区域中完成基因分型。每个标记物的单个卵囊基因型用不同的阴影模式 表示：纯合的非洲（AA，采用对角线），纯合的巴西（BB，采用网格线），和杂合的（AB，采用对 角虚线）。沿着染色体13的标记物的染色体位置和引物显示于表2。QTL边界用箭头指示。
[0029] 图8显示冈比亚按蚊抗性（R)株中Pfs48/45敲除（KO)的NF54恶性疟原虫寄生 虫的表型。R蚊子中每个中肠的黑化（X轴）和活（y轴）Pfs48/45K