， 确定两种最优先考虑的候选基因，Pfs47和Pfs48/45,其分别具有4和2个非同义多态性， 并编码已知在寄生虫性阶段的表面表达的蛋白。
[0117] Pfs47和Pfs48/45在疟原虫的配子母细胞阶段表达，并已被研宄作为传播阻断 疫苗的候选物。来自 Radboud University Nijmegen Medical Center 的 Sauerwein 和 Eling博士以及合作者在非洲NF54恶性疟原虫株中产生所述两种基因的敲除（KO)品系， 它们对蚊子的疱原虫感染性的作用已被公开（van Dijk et al·，2001 ;van Schaijk et al.，2006)。已经证实，由于缺陷的生育力，Pfs48/45K0寄生虫以低水平感染蚊子。但感 染蚊子的该寄生虫能够避免蚊子免疫系统造成的破坏，表明该基因不介导寄生虫的免疫逃 避。如先前的报道，Pfs47K0寄生虫（在NF54遗传背景下）不具有生育力问题，并形成以 较高数目侵入斯氏按蚊中肠的动合子。但是，已发现当Pfs47不再表达时，寄生虫在冈比亚 按蚊抗性株中不再存活，表明它们不再能够逃避蚊子的免疫系统。这通过沉默蚊子免疫因 子TEPl (蚊子抗疟原虫应答的关键效应因子）的表达得到确认。当TEPl表达被沉默时， Pfs47K0寄生虫不再被消灭，表明寄生虫被蚊子主动杀死。此外，在闪比亚按蚊G3株（其 对野生型NF54恶性疟原虫寄生虫的感染是高度易感的）中也观察到TEPl-介导的杀死 Pfs47K0寄生虫。
[0118] 实施例2-Pfs47基闵介导的蚊子免痔系统洮避
[0119] 已发现Pfs47是恶性疟原虫寄生虫在冈比亚按蚊（在非洲是人类疟疾的主要天然 媒介）中存活的关键因子。使用遗传作图、连锁群选择和功能基因组学的组合来鉴定Pfs47 作为允许寄生虫感染闪比亚按蚊但不激活蚊子免疫系统的恶性疟原虫基因。Pfs47的破坏 极大降低蚊子中的寄生虫存活，这种表型可以通过寄生虫的遗传补充或蚊子补体样系统的 破坏来恢复。Pfs47抑制对激活补体样系统非常关键的中肠硝化应答。直接的实验证据表 明，Pfs47介导的免疫逃避对通过闪比亚按蚊的有效人类疟疾传播非常重要。闪比亚按蚊 L3-5株被挑选为对猴疱原虫（plasmodium cynomolgi)(猴疱）抗性的（R)，但是也消灭大 部分其他疟原虫种，包括来自新大陆的恶性疟原虫株，并在死的寄生虫周围形成黑化包膜 (即，黑色素（黑色不溶性色素）的沉积）。
[0120] 与此相反，所述株对一些非洲的恶性疟原虫株（诸如NF54、3D7和GB4)的感染是 高度易感的。来自疟疾流行地区（其中冈比亚按蚊是天然的媒介）的一些寄生虫品系能够 逃避蚊子的免疫系统。共感染实验显示，对恶性疟原虫株的免疫应答（或其不存在）不影 响同一蚊子中肠中存在的其他寄生虫的命运；表明寄生虫存活是由恶性疟原虫株之间的遗 传差异决定的。在该研宄中，数量性状基因座（QTL)作图、连锁群选择和功能基因组学用于 鉴定通过调节宿主免疫系统来促进感染的第一恶性疟原虫基因。
[0121] 在用两种恶性疟原虫品系一来自巴西的7G8(97_ 100%黑化的）和来自加纳的 GB4 (0 - 3 %黑化的）（图1A) -（先前已经经历遗传杂交）感染的冈比亚按蚊R之间存在 表型差异。对9个克隆子代品系进行表型分析。它们中的5个具有GB4表型并且生存良好 (0-5 %黑化），而4个具有7G8表型并且大部分是黑化的（98 - 100 %黑化）（图1B)。子代 中存在两种不同的表型说明单基因性状。对其他16个子代品系重复尝试表型分析未能成 功，因为大部分克隆品系失去产生成熟的配子母细胞的能力。使用先前报道的连锁图和得 到的表型，QTL作图鉴定出3个奇数对数分数（LOD)峰（图1C)，但是它们中只有一个（位 于染色体13(Chrl3))是有显著意义的（P〈0. 05)。对该基因座重组位点的边界精确作图，限 定了编码41个基因的172-kb区域（图5 ;表1)。
[0122] 连锁群选择分析（一种允许从头定位编码疟疾寄生虫的可选择表型的基因座）用 于获得Chrl3中基因座的独立证实。来自最初遗传杂交的非克隆重组子代用于产生配子母 细胞，并感染R株或允许易感的（S)冈比亚按蚊G3品系（两种胃肠外寄生虫品系均在其中 存活）。分离单个卵囊，经历全基因组DNA扩增，并沿着Chrl3对多个标记物进行基因分型。 卵囊衍生自二倍体动合子阶段，并且对非洲GB4 (AA)或巴西7G8等位基因（BB)是纯合的， 或是杂合的（AB)。在S株中，BB基因型在Chrl3的中央区域中是高度丰富的，达到>90% 的频率（图2A ;图6,表2)，其已经在来自遗传杂交的子代克隆中观察到并且不是由于蚊子 的选择，因为两种亲代株均在S株中存活。在R株中，鉴定了良好限定的区域，用虚线表示， 其中BB基因型处在强阴性选择下并且全都不存在（0% )(图2A)。与此相反，BB基因型在 相同染色体区域的发生率在S株中是55% (P〈0. 00001 ; X 2检验），其对寄生虫不施加选择 压力。值得注意的是限定该区域的两种标记物（图2A，虚线）与限定通过QTL分析鉴定的 172-kb区域的那些标记物相同。尽管对从R株解剖的其他50个单个卵囊进行基因分型，在 强选择下对于所述区域中的任意标记物都没有检测到具有BB基因型的卵囊（图7)。因此 无法将基因座进一步变窄。
[0123] 对动合子阶段41个候选基因的基因表达分析鉴定出亲本品系之间表达具有较大 差异（8倍或更高）的3种基因：？&47(??13_0248)、硫氧还蛋白2(麻1^13?1.225)和核酸结 合蛋白41^42(麻1^13?1.233)(图28;表3)(?〈0.0001 4检验）。在配子母细胞阶段，硫氧还 蛋白2和ALBA2在亲本品系之间的表达也具有差异（表3)。对41个候选基因编码区的测 序鉴定出亲本品系之间在13个基因中的非同义单核苷酸多态性（SNP)(图2B，深红色斑点； 表4)。这些基因的3个中的一些非同义SNP，Pfs47中的4个SNP，以及Pf48/45(PF13_0247) 和乙醇胺磷酸胞苷酰基转移酶（PF13_0253)中的1个还与两种其他恶性疟原虫株中的寄生 虫存活有关（图2B，黑色箭头；表4)。GB4SNP等位基因被也存活的NF54和3D7株共有，而 7G8SNP等位基因由被R株黑化的SL株共有。基于基因表达的巨大差异和/或与其他株的 存活有关的多态性（表5)，挑选5种基因作为最优先考虑的候选物用于详细的遗传分析。
[0124] 两种最优先考虑的候选基因，Pfs47和Pfs48/45,编码6-半胱氨酸蛋白家族的成 员（其在配子母细胞表面表达）。先前NF54品系中的基因破坏实验显示Pfs48/45对配子 生育力非常重要。Pfs47在雌性配子母细胞中表达，但对恶性疟原虫受精不是必要的，尽管 其在柏氏疟原虫中的同源物是雌性配子的生育力需要的。Pfs48/45敲除（KO)品系（NF54 遗传背景）在R株中的感染强度较低，可能归因于降低的生育力，但是侵入中肠的那些寄生 虫具有和野生型（WT)NF54寄生虫类似的表型，只有3%被黑化（图8);表明逃避蚊子免疫 系统不需要Pfs48/45。与此相反，Pfs47K0(NF54遗传背景）寄生虫发育并侵入中肠，但被 尺蚊子清除（99%黑化）（图34);然而，尽管？&471(0寄生虫不被3蚊子黑化（图3〇,3株 中的感染水平（中值为1个卵囊/中肠）远远低于斯氏按蚊中的感染水平（60个卵囊/中 肠的中值）（图9)。值得注意的是，这种斯氏按蚊株已被挑选为对恶性疟原虫感染高度许可 的。
[0125] 为了确定Pfs47是否与蚊子免疫系统相互作用，通过沉默TEPl来破坏闪比亚按 蚊的补体样系统。降低TEPl表达完全逆转R株中Pfs47KO寄生虫的黑化（图3B)。在冈 比亚按蚊S株（G3)中，NF54WT或Pfs47KO寄生虫均不被黑化（图3C);然而，虽然TEPl沉 默对NF54WT寄生虫的感染没有显著影响（图3C)，它显著增加 Pfs47KO寄生虫的感染强度 (P〈0.0 OOlMann-Whitney 检验）和发生率（P〈0. 001 ; X 2检验）（图 3C)。这表明，Pfs47 对 于恶性疟原虫寄生虫在闪比亚按蚊中逃避TEPl介导的两种良好表征的免疫应答来说是必 需的：在R株中杀死然后黑化，在S株中寄生虫裂解但无黑化。
[0126] Pfs47蛋白存在于WT NF54动合子的表面，侵入中肠的阶段，但不存在于Pfs47KO 寄生虫（图3D)。在S蚊子中评价HPX2和NOX5(介导响应柏氏疟原虫感染的中肠硝化并 促进TEPl活化的两种酶（2))的表达。HPX2和NOX5不被NF54WT寄生虫诱导，并且硝化水 平低于未感染的对照（图3E)。与此相反，Pfs47KO寄生虫诱导HPX2和NOX5的表达，以及 有效的硝化应答，表明Pfs47可以通过抑制中肠上皮硝化应答来阻止TEPl介导的裂解（图 3E) 〇
[0127] 最后，通过用不同的Pfs47等位基因补充Pfs47KO品系，证实了 Pfs47对于寄生 虫存活的重要性（图10-13)。与预期一致，当被补充的寄生虫维持在持续药物压力下时， Pfs47的NF54等位基因逆转R株中的黑化表型（0%黑化），证实Pfs47的这种等位基因足 以逃避免疫系统（图4A)。当降低药物压力时，观察到逆转为混合的存活/黑化表型（图 14)。与此相反，利用7g8等位基因的补充未能拯救R株中的寄生虫，因为观察到99%的黑 化（图4B)。
[0128] 综上，Pfs47被鉴定为恶性疟原虫必要的存活因子，其允许寄生虫逃避闪比亚按蚊 (非洲主要的蚊子媒介）的免疫系统。但是，其他寄生虫基因也可以参与该过程。有趣地 是，Pfs47是在野外分离物中具有显著种群结构的高度多态性基因，并在非洲以外的世界地 区显示极其固定。我们的发现表明，Pfs47的种群结构可能归因于恶性疟原虫对非洲以外存 在的各种按蚊媒介种类的适应作用。Pfs47的7G8等位基因足以逃避S蚊子（但非R株） 中的TEPl补体样系统的事实表明，媒介中也存在遗传差异，这决定了与表达特定Pfs47等 位基因的寄生虫的相容性。看起来Pfs47在恶性疟原虫中进化出以下功能：增加冈比亚按 蚊中的寄生虫存活，并导致，至少部分地，非洲高流行地区非常高的疟疾传播率。破坏Pfs47 的免疫调节活性可证明是降低疟疾向人类传播的有效策略。
[0129] 实验方法和材料
[0130] 实施例2. 1-冈比亚桉蚊和疟原虫寄牛虫
[0131] 使用闪比亚按蚊L3-5抗性株和疟原虫易感G3株。在标准实验室条件下，按 照12小时光暗循环在27°C和80%湿度下饲养蚊子。使用的恶性疟原虫株一GB4,7G8， GB4x7G8杂交子代（克隆和非克隆的），NF54, NF54-Pfs47K0,被补充的NF54-Pfs47K0和 NF54-Pfs48/45K0-在0+人红细胞中维持，使用添加25mM HEPES，50mg/l次黄嘌呤，25mM NaHCO3和 10% (v/v)热灭活的 0+型人血清（Interstate Blood Bank, Inc. ,Memphis, TN) 的RPMI 1640培养基，在37°C以及5% 02, 5% CO2和平衡N2的气体混合物中。
[0132] 实施例2. 2-利用恶件疟原虫人工感染蚊子以及QTL分析
[0133] 通过膜饲喂，利用恶性疟原虫配子母细胞培养物人工感染雌性冈比亚按蚊。按照 先前 Ifediba 等人（（1981)Nature 294,364)的描述，利用 5%血细胞压积（hematocrite)， 1-2%寄生虫血症（parasetimea)并且没有任意选择药物的条件下诱导配子母细胞形成。 14-16天龄的成熟配子母细胞培养物（阶段IV和V)用于饲喂蚊子，在37°C使用膜进食器 30分钟，并将它们用0+红细胞（40% v/v，溶于0 +人血清）稀释4-10倍。感染后8 - 10天 解剖中肠，利用溶于水的0.1% (w/v)红汞对卵囊染色，并用光学显微镜计数。至少进行两 次感染。使用非参数Mann Whitney检验比较对照和实验组之间单只蚊子中的寄生虫数量 分布。使用X 2检验比较蚊子的感染发生率。进行闪比亚按蚊中恶性疟原虫黑化的数量性 状基因座（QTL)分析，表型表示为黑化占观察到的总寄生虫（活的加黑化的）（利用先前获 得的恶性疟原虫GB4x 7G8杂交子代克隆的基因型）的百分比，使用R/QTL(22)及其界面J/ QTL。利用假定表型数据的正常或二元分布的区间作图完成所述分析，两种分析均得出类似 的结果，在染色体13上具有一个显著的LOD峰。呈现不改变真实的实验值并假定正态分布 的结果。
[0134] 实施例2. 3-微卫星和SNP基闵分塑
[0135] 利用来自无性恶性疟原虫培养物的DNA和表Sl所述的引物，通过PCR扩增MS标 记物来进行恶性疟原虫克隆子代品系的微卫星（MS)基因分型。在ABI 31000DNA测序仪 (ABI，Fullert