on，CA)中运行PCR产物以确定它们的大小。使用细针在显微镜下从感染的中 肠解剖单个恶性疟原虫卵囊，置于9 μ I TE缓冲液中，并在-70°C冷冻直至使用。按照制造 商的方案使用GenomePlex(Sigma)进行单个卵囊的全基因组扩增，除了退火/延伸步骤是 在60°C完成的之外（因为恶性疟原虫序列中A/T含量较高）。使用表S2所述的引物和探 针，通过Taqman测定法（ABI，Fullerton，CA)完成单核苷酸多态性（SNP)基因分型。使用 的Taqman PCR反应条件是以下步骤：95°C 10分钟，然后是92°C 15秒和60°C 1. 5分钟的 50个循环。
[0136] 实施例2. 4-基闵表汰aPCR和测序
[0137] 对配子母细胞培养物或感染后24小时的冈比亚按蚊中肠（okinete阶段） 评价基因表达，通过使用RNAeasy试剂盒（Qiagen, Valencia, CA)提取总RNA，利用 Quantitect 试剂盒（Qiagen)和 SYBR green qPCR DyNamo HS (Finnzymes, Espoo, Finland) 合成cDNA。使用恶性疟原虫基因 Pfl0_0203(ADP-核糖基化因子）作为内 参，利用 PCR 引物 F 5Z-GATGCTGCTGGAAA AACTAC-3Z (SEQ ID N0:217)和 R 5Z-CCTACATCCCATACGGTAAA-3Z (SEQ ID N0:218)。使用的其他引物描述于表 S6。qPCR 在标准条件下进行，使用〇.5μΜ每种引物，95°C 15分钟的初始变性步骤，然后是45个循 环：94°C 10秒，50°C 20秒和60°C 30秒，最后在60°C延伸5分钟。按照类似的方式评价 冈比亚按蚊Hpx2和Nox5的基因表达，使用SYBR green qPCR以及闪比亚按蚊核糖体S7基 因作为血液饲喂对照的内参，饲喂后24小时的NF54WT感染的或p47K0感染的蚊子中肠， 使用如下引物：Nox5F5'-TCATGCATCGCTACTGGAAG-3'（SEQ ID N0:219)，Nox5R 5'-CCAG AAAAGTCCACCTTGG-3' （SEQ ID N0:220)，Hpx2F 5'-CCGCTTCTACA ACACGATGA-3' （SEQ ID NO: 221)，Hpx2R 5? -CGACCAGATGGGCAA GTAiU (SEQ ID NO: 222) , S7F 5'-AGAACCAGCAGACCACCATC-3' （SEQ ID NO:223)，S7R 5'-GCTGCAAACTTCGGCTATTC-3' （SEQ ID NO:224)。对于这些基因，在标准条件下进行qPCR，使用0. 5μΜ每种引物，95°C 15分钟 的初始变性步骤，然后是45个循环：94°C 10秒，55°C 20秒和72°C 30秒，最后在72°C延 伸5分钟。在提取的DNA上对GB4和7G8株的染色体13QTL区域中的候选基因进行测序。
[0138] 实施例2. 5-dsRNA介导的蚊子基闵敲低
[0139] 按照 Molina-Cruz 等人（（2008) J Biol Chem 283,3217)先前的描述，在羽化后 1 - 2天对单只雌性闪比亚按蚊进行注射。简单来说，在获得疟原虫感染的血餐之前3-4天， 给蚊子注射69 μ 1 3- μ g/ μ I dsRNA溶液。使用闪比亚按蚊CDNA和引物（先前描述在5' 端添加 T7聚合酶启动子位点），通过PCR得到的DNA模板，使用MEGAscript' RNAi试剂盒 (Ambion，Austin，TX)产生 dsRNA TEPl 和 LacZ。使用引物TEPl-qF(5 z -GTTTCTCACCGCGTTCG T-3 z )(SEQ ID N0:225)， TEPl-qR(5 z -AACCAATCCAATGCCTTCTC-3 z )(SEQ ID N0:226)，通 过定量实时PCR在完全糖饲喂的蚊子中测定TEPl基因沉默，发现与注射LacZ的对照相比， 注射dsTEPl的蚊子中TEPl基因低84%。
[0140] 实施例2. 6-恶件疟原虫动合子的免痔染色
[0141] 在包被聚-L-赖氨酸（0. 01% )的玻璃载玻片上制备来自感染后24-28小时蚊子 中肠的涂片，4°C保存直至使用。在湿润小室中将干燥涂片在溶于PBS的4%多聚甲醛中 于室温（RT)固定1小时。在室温用溶于PBS的5% BSA将涂片封闭30分钟，并在室温用 0. 01% Tween 20清洗10分钟。与一抗（大鼠单克隆抗Pfs47抗体47. 1、47. 2和47. 3或 小鼠单克隆4B7抗Pfs25,用溶于PBS的1% BSA按照1:500稀释）在4°C孵育过夜。载玻 片在室温用0. 01 % Tween 20清洗两次，用PBS清洗一次，每次10分钟。在室温与用溶于 PBS的1% BSA按照1:500稀释的二抗（Alexa Fluor-488标记的山羊抗大鼠 IgG或Alexa Fluor-555标记的山羊抗小鼠 IgG，Invitrogen)孵育1小时。如上清洗载玻片。利用包含 DAPI的Vectashield封固剂覆盖涂片。
[0142] 实施例2. 7-中肠硝化测宙
[0143] 按照Oliveira等人（(2012) Science 335, 856)先前的描述进行硝化测定。简单 来说，对于每种对照和感染组，将5个中肠解剖、破碎、用多聚甲醛和戊二醛固定、PBS洗涤， 然后在氨基三唑中孵育。沉淀碎片然后与左咪唑孵育，用PBT封闭并洗涤。将碎片用PBT 重悬，并分为技术重复（technical replicates)，每种代表等同的一段中肠。在4°C将这些 重复与溶于PBT的抗硝基酪氨酸一抗（1:3, 000)孵育过夜。样品用PBT洗涤，并与溶于PBT 的偶联碱性磷酸酶的二抗（1:5,000)孵育，然后与P NPP (对硝基苯酚磷酸盐）孵育，利用 分光光度读板器在405nm读数。通过将未饲喂的对照样品标准化到100来确定相对硝化， 并代表两种生物学重复中每一种的4-5次技术重复的平均值。
[0144] 实施例2. 8-恶件疟原虫Pf s47K0的遗传补充
[0145] 按照 Deitsch 等人（(2001)Nucleic Acids Res 29, 850)先前的描述进行寄生 虫转染。简单来说，150μ1清除白细胞的红细胞（RBC) (S印acell R-500II，Fenwall)用 不完全 cytomix(120mM KCl，0.15mM CaCl，2mM EGTA，5mM MgCl2, IOmM K2HP04/KH2P04,25mM HEPES，用K0H调节pH7.6)洗涤一次，并用 400 μlcytomix重悬。在无菌条件下将质粒 (100 μ g，溶于cytomix，浓度为1 μ g/ μ 1)添加到冷冻的电穿孔比色皿（Bio-Rad，0. 2cm电 极）中的RBC中，在310V和975 μ F电容的Bio-Rad Gene Pulser II中完成电穿孔。电 穿孔的RBC用12ml完全培养基洗涤3次，并与用Percoll-山梨醇梯度纯化的恶性疟原虫 NF54-Pfs47K0裂殖体混合。每天更换培养基，一旦培养物达到6%寄生虫血症，添加选择药 物（10 μΜ乙胺嘧啶和4 μΜ BSD)，并持续维持无性培养，除非另有说明。在没有选择药物 的条件下进行配子母细胞培养。按照Van Schaijk等人（(2006)M〇1 Biochem Parasitol 149, 216)先前的描述制备恶性疟原虫NF54-Pfs47K0。制备包含来自3D7(获自NF54的克隆 系）或7G8的Pfs47等位基因和它们假定的内源5'启动子区域（启始ATG上游l，030bp)和 3'UTR(终止密码子下游162bp)的质粒，通过使用下列引物扩增来自恶性疟原虫3D7或7G8 品系的 Pfs47 :Pfs47_inf_F:5' -AGCTGGAGCTCCACCGCGGTTTATAAAAACATTCCTAACACATT-3'（S EQIDN0:227)*Pfs47_inf_R:5'-CGGGGGATCCACTAGTATTTACCTTACATTTATCTCCA-3'（SEQ ID N0:228)(涉及Pfs47的序列用粗体字母表示，序列的其余部分与用于In-Fusion克 隆的质粒补充）。PCR产物包括Pfs47开放读码框（ORF)的上游（Ikb)和下游（0.16kb) 的非编码区。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech)将PCR产物克隆入先前开发 的pCBM-BSD质粒，所述质粒通过利用SacI和Spell (New England Biolabs)的限制性内 切酶消化而线性化（图10)。使用Plasmid Mega试剂盒（Qiagen)进行质粒纯化，并进 行额外的乙醇沉淀洗绦以在cytomix中重悬质粒（1 μ g/ μ 1)。按照Van Schaijk等人 ((2006)M〇1 Biochem Parasitol 149,216)先前的描述，利用引物 BVSOl 和 L430 通过 PCR 证实补充品系的Pfs47K0背景（图11)。利用针对Pfs47编码序列的引物（0248」3_?5'_ AGTATGCAATAAATTCATCGTTC-3'（SEQ ID NO: 229)和针对 pCBM-BSD 骨架的引物（BSD3, _R 5' -ATATAAGAACATATTTATTAAACT GC-3'）（SEQ ID NO: 230)，通过 PCR 证实补充品系中具有 Pfs47插入物的pCBM-BSD质粒的存在（图11)。通过对来自IV-V阶段配子母细胞培养物 的cDNA进行qPCR，证实附加补充的Pfs47K0品系中的Pfs47mRNA表达（图12)。
[0146] 实施例2. 9_Pfs47蛋白表达的Western ￡口迹分析
[0147] 通过Western印迹检测来自不同恶性疱原虫品系的配子母细胞中Pfs47蛋白的 表达（图13)。通过皂苷处理来分离配子母细胞。简单来说，将30ml体积的配子母细胞培 养物（14天龄）离心，室温下（RT)在包含0. 08%皂苷的5ml PBS中孵育沉淀物10分钟。 将分离的寄生虫离心，用PBS清洗两次，-70°C冷冻直至使用。冷冻的沉淀物在100 μ 1水 中重悬，将其中5 μ 1与NuPage LDS样品缓冲液混合，70°C加热10分钟，在4-12% NuPage Bis Tris凝胶（Novex)中分级，并使用iBIot?干式印迹系统（Invitrogen)转移到硝酸纤 维素。用溶于 Tris 缓冲盐水并含有 Tween 20(0. 05M Tris，0.138M NaCl，0.0027M KCl，pH 8 ;0. 05% Tween 20)的5%奶粉对所述印迹在4°C封闭过夜，然后与用所述奶粉溶液1:200 稀释的抗Pfs47大鼠单克隆抗体47. 1、47. 2、47. 3(lmg/ml)的集合体在室温孵育2小时。 随后将所述印迹与用奶粉溶液1:10, 〇〇〇稀释的抗大鼠 IgG碱性磷酸酯酶偶联物（lmg/ml Promega)在室温孵育1小时。利用Western Blue稳定底物（Promega)检测抗体染色。
[0148] 实施例3-Pfs47的兔多克降抗体
[0149] 将编码免疫原性的Pfs47片段的多核苷酸片段转染大肠杆菌以大量产生重组 Pfs47多肽。然后纯化所述重组免疫原性多肽。为了产生多克隆抗体，使用纯化的免疫原性 多肽或编码Pf S47蛋白的DNA疫苗质粒重复免疫兔或小鼠以产生多克隆抗血清。在4-6周 期间内采集血清，并通过间接ELISA监测抗体质量。如果需要，使用蛋白A亲和层析法，使 多克隆抗体与其他血清蛋白分开而纯化。
[0150] 实施例4-Pfs47的单克降抗体
[0151] 如实施例1所述，使用编码Pfs47免疫原性片段的多核苷酸产生大量Pfs47免疫 原性片段。使用纯化的免疫原性多肽免疫小鼠。分离脾，筛选来自脾的B细胞以挑选产生 针对Pfs47免疫原性片段的抗体的那些B细胞。然后将挑选的B细胞与小鼠肿瘤（永生化 的）细胞系融合以形成杂交瘤。针对抗Pfs47免疫原性片段的抗体生成，对杂交瘤进行筛 选。然后允许挑选的杂交瘤培养增殖以产生所需的单克隆抗体。
[0152] 实施例5-包括Pf s47的药物组合物
[0153] 基本上纯的P47蛋白或其免疫原性片段（参见实施例3)可以与佐剂和药学上可 接受的载体混合以产生根据现有的Good Manufacturing Practices适合作为人类疫苗使 用的药物组合物。可以添加佐剂以增强对P47或其片段的免疫应答。合适的佐剂可以包括 传统佐剂诸如明矾或新型佐剂诸如葛兰素史克（GSK)ASOl佐剂或实验性佐剂诸如GLA-SE 佐剂，由Steve Reed及其同事在传染病研宄所（IDRI)中开发。此外，可以添加延长保