束，术语Pfs47对蚊子免疫系统的"操纵"表示对蚊子正常免疫 系统机制（其通常能够损伤或实质性减少寄生虫）的抑制、逃避或其他避免。
[0083] 本发明涉及一种药物组合物，其包含P47蛋白、其免疫原性片段、蛋白或免疫原性 片段的变体，或其混合物。用于本发明的全长恶性疟原虫表面蛋白P47(Pfs47)和间日疟原 虫表面蛋白P47(Pvs47)蛋白分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。免疫原性片段一 定不能缺失对表位的形成或保留必不可少的任何序列。同样，变体序列必须保留对预定靶 标的期望功能或效应必需的序列。P47、免疫原性片段或变体可以包括不阻断或防止感兴趣 的表位或其他功能序列的形成的其他序列。药物组合物可以另外包括可用于引发免疫应答 的其他人类病原体抗原，包括流感、麻瘆、汗毒、白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎病毒、乙 肝病毒、水痘、脑膜炎奈瑟氏菌（N. meningitides)和风瘆。
[0084] "免疫原性片段"具有至少5个氨基酸的长度。随着增加的优选程度，免疫原性片 段的长度是至少7、9、11、13、15、17和19个氨基酸。所述片段可以产生阻断疟疾传播的抗 体。
[0085] P47的"变体"或其免疫原性片段是与P47蛋白（Pfs47或Pvs47)或其免疫原性片 段具有至少约80%相同性的多肽，并保留免疫原性功能。在逐渐优选的实施方案中，所述变 体与P47蛋白或其免疫原性片段具有至少约85 %、90%、95%、98%或99%的相同性。
[0086] 本发明还包括重组多核苷酸，其包含编码P47蛋白的免疫原性片段、所述蛋白或 免疫原性片段的变体的核苷酸序列。P47片段或变体可以是，例如，Pfs47或Pvs47。免疫 原性片段长至少约5个氨基酸。由核苷酸序列编码的变体与所述免疫原性片段具有至少约 80%的相同性。
[0087] 在另一个实施方案中，本发明包括载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包括编码 P47免疫原性片段或P47免疫原性片段的变体的核苷酸序列。包括质粒和病毒载体的合适 载体是本领域已知的。还可以使用本领域已知的方法将载体转染宿主细胞。表达载体，诸 如VR1020质粒载体，可用于免疫动物或在脊椎动物细胞（诸如人肾细胞）中表达P47,并获 得重组蛋白。
[0088] P47蛋白、其免疫原性片段或变体可以通过提供期望的表位或功能序列的任意方 法来产生。优选的方法是在大肠杆菌中重组表达，以提供天然构象的非糖基化抗原。这是 尤其有用的，因为天然Pfs47是非糖基化的。可选地，可以使用杆状病毒系统表达P47,并且 可以从重组蛋白化学去除糖基化。
[0089] 在另一个实施方案中，P47蛋白、其免疫原性片段或其变体可以适当修饰，以增强 诸如体外稳定性等特性，或体内特性（包括其药代动力学）。
[0090] 本发明的药物组合物可以通过将与药学上可接受的载体混合的化合物组合的已 知方法来制备。合适载体以及它们与蛋白的制剂描述于Remington' S Pharmaceutical Sciences (16th ed. Osol, E. ed. , Mack Easton Pa. (1980)) 〇
[0091] 本发明还包括一种实质性抑制或实质性降低疟原虫寄生虫传播的方法，通过给脊 椎动物施用包含P47蛋白、其免疫原性片段或其变体的药物组合物。所述组合物还可以包 括药学上可接受的载体、佐剂和/或药学上可接受的赋形剂。
[0092] 包含P47、其免疫原性片段或其变体的药物组合物可以用作疫苗，通过给人类和高 等灵长类动物施用以阻断疟原虫传播。当给人施用时，药物组合物可以另外包括可用于引 发免疫应答的其他人类病原体抗原，包括流感、麻瘆、汗毒、白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质 炎病毒、乙肝病毒、水痘、脑膜炎奈瑟氏菌和风瘆。
[0093] 可以通过任意合适的方法（包括静脉内、肌内的、鼻内和皮下）实施给人类或高等 灵长类动物施用本发明的药物组合物的方法。
[0094] 本发明还包括一种用于在脊椎动物中实质性阻断或实质性降低疟原虫寄生虫的 寄生虫传播的药物组合物，其中所述组合物包含与P47或其免疫原性片段或变体特异性反 应的抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。 所述寄生虫可以是，例如，恶性疟原虫或间日疟原虫。
[0095] 本发明还包含一种在人类或高等灵长类动物的群体中实质性阻断或实质性降低 疟原虫寄生虫的传播的方法，包括给至少一个人或高等灵长类动物施用药物组合物，所述 药物组合物包含与P47或其免疫原性片段或变体特异性反应的抗体或其片段。所述组合物 还可以包括药学上可接受的载体。
[0096] 用于上述方法的组合物还可以包括一或多种人类病原体的抗原，包括但不限于， 流感、麻瘆、汗毒、白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎病毒、乙肝病毒、水痘、脑膜炎奈瑟氏菌 和风瘆。所述组合物还可以包括佐剂。
[0097] 施用包括所述抗体或相关化合物的药物组合物的方法包括本领域已知的方法，包 括，但不限于，静脉内、肌内、鼻内和皮下。
[0098] 在另一个实施方案中，本发明包含一种给蚊子提供与一或多种抗原特异性反应的 一或多种抗体或其片段或变体的方法，包含给人类施用包括所述一或多种抗原的组合物。 所述抗原可以是P47蛋白或其免疫原性片段或变体。P47可以是，例如，来源于恶性疟原虫 的Pfs47或来源于间日疟原虫的Pvs47。
[0099] 在另一个实施方案中，本发明包含一种重组质粒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸 编码P47蛋白（或其免疫原性片段或变体），或对P47 (或其免疫原性片段或变体）特异的 抗体（或抗体片段）。多核苷酸的翻译可以处于病毒启动子诸如劳斯肉瘤病毒或巨细胞病 毒的控制下。所述质粒还可以包括多腺苷酸化信号诸如牛生长激素或兔球蛋白多腺苷 酸化序列。所述质粒可用于处理哺乳动物的方法，包含给需要其的个体施用药学有效量的 重组质粒。
[0100] 本发明还包含一种用于鉴定可以干扰Ρ47功能的药剂或药物的方法。通常，该方 法涉及制备感染的蚊子群体，通过使用例如MFA，将蚊子群体与包括疟原虫配子母细胞的血 餐接触，或用包括疟原虫配子母细胞的血餐饲喂蚊子群体。可以将候选药剂加入配子母细 胞培养物，以确定所述候选分子是否影响蚊子实质性降低疟原虫寄生虫传播的能力。由此 确定的改善蚊子降低疱原虫传播的能力的候选分子被确定为药剂。使用对Pfs47或Pvs47 特异的细胞系可以针对干扰P47的可能性对大量候选药剂进行预筛选。
[0101 ] 在上述方法中，疟原虫寄生虫可以在恶性疟原虫配子母细胞培养物中提供，或作 为来自感染供体的血液提供。此外，可以在MFA中控制恶性疟原虫与蚊子的接触。还可以 使用MFA将所述候选分子与感染的蚊子群体接触。
[0102] 本发明还包含用于鉴定可用作疫苗的药剂的方法。在这样的一种方法中，所述药 剂能够在已经确定使JNK信号转导途径失活的系统中恢复JNK信号转导。将所述系统与候 选药剂接触，并测定所述候选药剂对恢复JNK信号转导的效应。在一个方面，所述系统包括 果蝇S2细胞或其他昆虫细胞系，其中通过将细胞与P47接触来失活完整的JNK信号转导途 径。可以将果蝇S2细胞或其他昆虫细胞的完整JNK信号转导途径失活的方法可以通过，例 如：a)通过向培养基中添加重组P47蛋白将所述细胞的表面暴露于P47 ;和/或b)利用表 达质粒转染细胞，从而在细胞的细胞质中表达重组P47。通过测量JNK磷酸化或通过使用报 道基因诸如绿色荧光蛋白（GFP)，可以确定候选药剂是否恢复果蝇S2或其他昆虫细胞系中 的JNK信号转导。
[0103] 在可选的实施方案中，鉴定可用作疫苗的药剂的方法使用蚊子作为测定系统，所 述蚊子已经被表达P47的疟原虫寄生虫感染，导致蚊子的JNK信号转导途径被抑制。这进而 导致蚊子补体样系统活化的缺失。在该实施方案中，通过蚊子实质性阻断寄生虫感染的能 力，可以明确恢复JNK信号转导的候选药剂。在一个方面，蚊子是闪比亚按蚊或其他按蚊， 并且疟原虫寄生虫是恶性疟原虫或间日疟原虫。
[0104] 本发明还包含一种转基因蚊子，其包含表达干扰P47功能的抑制因子的细胞。所 述抑制因子可以是外源多核苷酸序列，其编码特异性针对P47的抗体并干扰P47的免疫抑 制活性。可以使用本领域已知的方法获得多克隆或单克隆抗体。
[0105] 在另一个实施方案中，转基因蚊子是副转基因的，并利用编码抑制因子的多核苷 酸转染蚊子肠微生物群（microbiota)中天然的细菌。可以利用例如包含外源多核苷酸的 质粒容易地转染肠微生物群的共生细菌，在体外容易的生长，并输出外源多肽。该工程化的 细菌保持稳定并容易地输送到蚊子的肠，在那里它们持续输出外源多肽。外源多肽不能对 共生细菌或蚊子有毒性。通过这种机制，副转基因蚊子可以破坏疟原虫Pfs47的抑制功能， 允许蚊子的免疫系统识别疟原虫寄生虫并实质性降低它们的传播。
[0106] 例如，蚊子诸如闪比亚按蚊的合适共生生物，包括醋酸菌（AAB)，尤其是醋酸杆菌 属（Acetobacter)和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter)成员，以及成团泛菌（Pantoea agglomerans)。醋酸菌和成团泛菌已被确认为蚊子的天然共生生物。AAB细菌Asaia种 已被确认为"昆虫微生物群体内的优势细菌"，包括斯氏按蚊、五斑按蚊、闪比亚按蚊和埃 及伊蚊。AAB在蚊子中的主要栖息地已确认是胃肠道，其确保能够获得膳食来源的糖。 胃肠道是酸性、有氧的，并提供糖膳食，从而允许AAB的生长和繁殖。通过垂直与水平 传播途径，AAB经由宿主蚊子群体而自然传播。（Crotti，E.等人（2010)4卩卩1』1^;[1'011· Microbiol. 76(21) :6963 ;Wang S.等人（2012) Proc Natl Acad Sci USA109:12734-9) ·。
[0107] 用于副转基因蚊子的抑制因子可以是外源多核苷酸序列，其例如编码特异性针对 P47的抗体（其干扰P47的免疫抑制活性）。此外，可以通过本领域已知的方法获得多克隆 或单克隆的针对P47的抗体。
[0108] 还预期本发明包括一种检测或确定生物样品中疟疾抗体的方法。所述方法使用 P47 (或其免疫原性片段或变体），优选纯化或基本上纯化的，并且通常在体外进行。检测或 确定个体生物样品中的疟疾抗体可用于诊断目的，或用于监测先前确诊的患者对疟疾治疗 的反应和预后。
[0109] 所述方法包括以下步骤：提供或获得来自患有疟疾和P47抗体的个体的生物样 品；在允许形成免疫复合物的条件下将所述样品与P47蛋白或免疫原性片段接触；和检测 P47蛋白或片段与抗体的复合物的存在。
[0110] 测定方法使用允许P47(或其片段）结合生物样品中抗体的条件。这些条件包括 生理PH、温度和具有过量P47 (或片段）的离子强度，然后孵育。
[0111] 可以在溶液中进行所述方法的接触步骤。在该实施方案中，P47或其片段可以连 接可检测的标记。标记可以是，例如，荧光、化学发光、放射性或染料分子。可以通过已知的 方法，包括荧光测定法、化学发光法、放射分析法或比色法检测标记的复合物。在另一个方 面，在孵育期间，抗体和抗原的复合物可以发生免疫沉淀。
[0112] 可选的，可以利用固定到固相支持物上的P47进行所述方法的接触步骤。P47可以 是标记的，例如，利用荧光标记。固相支持物的实例包括，但不限于，硝酸纤维素（采用膜或 微量滴定孔形式）、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯胶乳、活化珠子，等等。这种方法还可 包括在支持物上形成复合物后去除未结合的组分的步骤。可以使用本领域已知的方法（包 括但不限于荧光测定法）实现与P47复合的抗体的检测。
[0113] 本发明还包括一种用于检测或确定生物样品中疟疾抗体的存在的试剂盒。所述试 剂盒包括P47蛋白、其免疫原性片段，或其变体；能够使P47蛋白、片段或变体与生物样品中 存在的抗疟疾抗体形成免疫复合物的缓冲液。在一个方面，将P47、片段或变体固定于固相 支持物（例如，ELISA板）上。所述试剂盒还可以包括用于去除未复合组分的洗涤液。
[0114] 本文引用的全部文献在此完整引入作为参考。 实施例
[0115] 实施例1-确认Pfs47对恶件疟原虫洮避冈比亚桉蚊的免痔系统非常重要
[0116] 已发现Pf s47是恶性疟原虫寄生虫在冈比亚按蚊（在非洲是人类疟疾的主要天然 媒介）中存活的关键因子。Pfs47允许寄生虫感染蚊子但不激活蚊子的免疫系统。通过对 巴西7G8X非洲GB4寄生虫之间的杂交子代进行典型QTL分析，对负责免疫逃避的基因组区 域作图。通过对来自杂交的重组群体的单个卵囊进行连锁群选择分析，确认免疫逃避基因 的基因组位置。这些实验限定了编码41个基因的171kb区域。确定这些基因中的每一个 在配子母细胞和动合子中的表达，并对它们来自两种株的编码区进行测序。基于所述分析