一种右旋糖酐酶及其在制备低分子右旋糖酐中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种右旋糖酐酶的制备方法及该右旋糖酐酶在制备低分子右旋糖酐中的应用，其特征在于该右旋糖酐酶的产生菌是从土壤中分离得到的棘孢青霉F1008，该菌株由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.8135。本发明成功运用棘孢青霉F1008发酵培养制得高酶活的右旋糖酐酶，该酶的催化温度为25～35℃，催化pH为5.0～6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且该右旋糖酐酶在多底物溶液中优先选择与高分子量的底物反应，非常适用于低分子量右旋糖酐的制备；运用棘孢青霉F1008右旋糖酐酶催化得到的低分子右旋糖酐种类包括重均分子量为10000Da、6000-8000Da及3000-5000Da的小分子右旋糖酐；该右旋糖酐酶催化反应条件温和、底物特异性强、能耗低，可以实现小分子右旋糖酐生产的提高产率、低碳、低成本化生产目标。
【专利说明】一种右旋糖酐酶及其在制备低分子右旋糖酐中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药与酶工程领域，具体地说是一种右旋糖酐酶的制备方法及其在制备低分子右旋糖酐中的应用。
【背景技术】
[0002]右旋糖酐(dextran)是一种链式葡聚糖，由葡萄糖单元以α-1，6_糖苷键连接而成，同时含有少量α-1，3-糖苷键组成的支链结构。右旋糖酐及其衍生物因具有安全、无毒等多种优点已被广泛应用于医药、工业、食品等多个领域，市场需求十分巨大(全球每年的需求近几百亿美金)。不同分子量的右旋糖酐具有不同的药用价值与生物学功能，重均分子量为20_70kDa的中分子右旋糖酐是临床上使用较多的药用级右旋糖酐，主要用作血浆代用品，治疗出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等；重均分子量为6-8kDa的低分子右旋糖酐是制备右旋糖酐铁的优良材料；重均分子量为3_5kDa的小分子右旋糖酐可进行硫酸化，得到的衍生化产品在医疗中可以用于抗血栓。
[0003]传统工业中，右旋糖酐的生产主要是通过肠膜状明串珠菌发酵结合酸解工序来进行，由于酸水解的随机无序性，得到的产品分子量分布不集中从而影响产品的质量；另外，由于利用盐酸水 解需要高温高酸等恶劣条件，能耗高，不利于环保、低碳，并且产品收率有待于提高。右旋糖酐酶能够催化降解高分子右旋糖酐，生产出能够适用于食品、化工、医药等领域的中、低分子量的多糖，酶催化反应条件温和、能耗低，从而能实现低分子量多糖生产工艺的绿色、环保、低碳目标，尤其有利于生物多糖在医药领域中的应用。
[0004]申请公布号CN102676615A的专利文本中描述的是右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶分布加入法制备药用级右旋糖酐，右旋糖酐酶必须在右旋糖酐蔗糖酶反应结束后加入，并且需要控制低的加酶量，反应时间短，为的是使中分子量的药用级右旋糖酐富集。本发明公开一种高酶活的右旋糖酐酶制备方法，并运用该酶在多底物溶液中优先降解大分子右旋糖酐的特性，与市售右旋糖酐蔗糖酶同时加入蔗糖溶液中，制备出系列低分子量的右旋糖酐，为低分子量右旋糖酐的双酶合成提供新的技术支撑。
【发明内容】
[0005]本发明为了克服现有技术的不足，提供一种右旋糖酐酶的制备方法及其在制备低分子量右旋糖酐中的应用。
[0006]本发明提供一种从土壤中筛选出的高酶活右旋糖酐酶产生菌-棘孢青霉，该菌株保减名称为:棘抱青霉F1008，保减单位:中国微生物囷种保减中心，保减日期:2013年09月13日，保藏号为CGMCC N0.8135 ;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0007]本发明运用棘孢青霉F1008发酵培养制得高活性的右旋糖酐酶，其制备步骤包括:
[0008]I)菌株活化:采用灭菌固体PDA培养基，将F1008菌株接种在试管斜面上，30_32°C下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；[0009]2)菌株种子发酵培养:种子培养基组分为每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g，蛋白胨 0.4g,K2HPO4.3Η200.lg,NaNO30.2g,MgSO4.7Η200.05g，KC10.05g,FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，将步骤I)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上30-32°C，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
[0010]3)发酵制备右旋糖酐酶:发酵培养基组分为每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g,蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g,KC10.05g, FeSO4.7H200.0Olg, pH5.0~5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按5%的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上30-32°C，转速220r/min下培养5天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；
[0011]4)右旋糖酐酶的分离纯化:将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后再进行硫酸铵盐析以及琼脂糖凝胶柱分离，得到纯的右旋糖酐酶酶液，运用DNS法测定酶活力。
[0012]5)右旋糖酐酶优先降解高分子右旋糖酐的特性:将步骤4)中得到的纯酶液与两种不同分子量右旋糖酐(底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw665?a)构成的双底物溶液进行混合，在25°C下催化反应，运用HPLC检测催化过程中两种底物的分子量变化，结果见图1，高分子量的底物E优先被降解，分子量不断降低，而低分子量的底物F在反应初期基本无变化，从而证实本发明公开的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有优先降解高分子右旋糖酐的特性。
[0013]本发明公开的棘孢青霉F1008能够产生高酶活性的右旋糖酐酶，该右旋糖酐酶的特征在于它的最适作用温度为25~35°C，最适催化pH为5.0~6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且该右旋糖酐酶在多底物溶液中优先选择与高分子量的底物反应，非常适用于低分子量右旋糖酐的制 备。
[0014]本发明公开棘孢青霉F1008右旋糖酐酶在制备系列低分子右旋糖酐中的应用，其方法按如下步骤进行:
[0015]按1000mL的反应体系计算，首先将60_200g的蔗糖溶解于ρΗ5.00.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，在25°C下同时添加2000-3000U的市售右旋糖酐蔗糖酶与2500-7500U的右旋糖酐酶，恒温搅拌反应22-26小时；然后将反应体系置于80°C下保温I小时灭活右旋糖酐蔗糖酶，纱布滤过变性酶蛋白后再置于沸水浴中20分钟灭活残留的右旋糖酐酶，再经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为系列低分子右旋糖酐溶液；
[0016]最后将该溶液进行旋蒸浓缩70°C旋蒸浓缩去除部分水分，浓缩至原体积一半后进行分级醇沉，采用四级划分:一级乙醇浓度为48，得到的沉淀为残余蛋白杂质及少量高分子糖酐；二级乙醇浓度为58，得到的沉淀为1000ODa的右旋糖酐；三级乙醇浓度为68，得到的沉淀物为6000-8000Da的右旋糖酐；四级乙醇浓度为78，得到的沉淀物为3000_5000Da的右旋糖酐；每级得到的沉淀置于80°C真空干燥箱中干燥4小时，即得到系列低分子右旋糖酐纯品。
[0017]本发明的优点在于:
[0018]棘孢青霉F1008发酵培养成本低，所产的右旋糖酐酶具有高酶活、高的底物特异性、多底物溶液中优先与高分子量的底物反应、能耗低等优点，在与右旋糖酐蔗糖酶组成的双酶体系中能够及时优先降解右旋糖酐蔗糖酶合成出的大分子量右旋糖酐，从而累积低分子右旋糖酐的量，非常适用于工业化运用，利用该酶与市售右旋糖酐蔗糖酶联合催化蔗糖制备系列低分子量右旋糖酐的反应条件温和、能耗低，工序简单；通过调节双酶体系的工艺参数(蔗糖浓度、双酶用量、反应时间)，可以实现对右旋糖酐分子量的调控；通过后期对反应液进行的浓缩处理，醇沉过程的无水乙醇用量大大减少，从而使得生产成本进一步降低；双酶催化得到的右旋糖酐分子量分布集中、种类多(lOOOODa，6000-8000Da，3000-5000Da)，总收率高；本发明可以实现低分子右旋糖酐生产工艺低成本化、环保、低碳、产率提高的目标，为酶法生产右旋糖酐的工业化奠定坚实的基础。
【专利附图】
【附图说明】:
[0019]本发明中的系列低分子右旋糖酐及低聚糖产品均运用高效液相色谱及糖电泳进行检测，现附上部分图谱如下:
[0020]图1为棘孢青霉F1008右旋糖酐酶催化多底物溶液过程中右旋糖酐的分子量变化；
[0021]图2为实例3中双酶法催化制备的右旋糖酐液相色谱图(重均分子量5272Da)； [0022]图3为实例4中双酶法催化制备的右旋糖酐液相色谱图(重均分子量8000Da)；
[0023]图4为实例4中双酶法催化制备的右旋糖酐液相色谱图(重均分子量4412Da)；
[0024]图5为实例5中双酶法催化制备的右旋糖酐液相色谱图(重均分子量6276Da)；
[0025]图6为实例5中双酶法催化制备的右旋糖酐液相色谱图(重均分子量350?a)；
【具体实施方式】:
[0026]以下通过具体实例对本发明做进一步解释说明，但并不限制本发明的内容。实施例I
[0027]一株产右旋糖酐酶高酶活性菌株F1008的分离方法，其包括如下步骤:
[0028]在99ml无菌水中加入Ig 土样(土样分别取自安徽合肥、安徽蛘埠、四川成都)制备土壤稀释液，在PDA培养基内加入青霉素溶液(100ml加入50 μ I )，倒入培养皿中，静止冷却成平板。采用稀释涂布法将稀释后的土壤溶液分别涂布于平板上，然后倒置于30°C恒温培养箱中培养，待菌长出后，用接种针将菌株挑取到另一灭菌的筛选培养基(配方:Dextran T20001g, NaNO30.3g, K2HPO4.3Η200.4g, MgSO4.7Η200.02g, KC10.02g,FeSO4.7Η200.001g，琼脂1.6g，水100ml, ρΗ5.0~5.5)上进行划线分离，然后将能够在筛选培养基上生长的单菌落挑取下来，转接到发酵培养基(配方:Dextranl00kDal.5g,蛋白胨
0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g, KC10.05g, FeSO4.7H200.0Olg,水100ml，pH5.0~5.5)上，于30°C、220r/min恒温继续发酵培养5天。将发酵液运用平半透明圈法(右旋糖酐琼脂平板)检测活性，透明圈越大表明发酵液所含的右旋糖酐酶酶活力越闻。
[0029]将初筛得到的活性菌株的发酵培养液用DNS比色法检测酶活力大小。在酶反应体系中加入待测液，测定酶活，右旋糖酐酶的活力测定为将4mL0.02mol/LpH5.0的醋酸盐缓冲液配制的3%右旋糖酐70kDa溶液置于40°C保温lOmin，再加入适当稀释的酶液ImL保温60min后,利用3，5 二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖，以在上述条件下每小时产生Img还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)，通过初筛及复筛分离纯化得到单菌落纯培养棘孢青霉F1008。
[0030]实施例2
[0031]运用棘孢青霉F1008生产右旋糖酐酶的技术方案:
[0032]I)菌株活化:采用灭菌固体PDA培养基，将F1008菌株接种在试管斜面培养基上，28-30°C下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；
[0033]2)菌株种子发酵培养:种子培养基组分为每100ml水中含有DextranlOOkDaL 5g，蛋白胨 0.4g,K2HPO4.3Η200.lg,NaNO30.2g,MgSO4.7Η200.05g，KC10.05g,FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，将步骤I)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上30-32°C°C，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
[0034]3)发酵制备右旋糖酐酶:发酵培养基组分为每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g,蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g,KC10.05g, FeSO4.7H200.0Olg, pH5.0~5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按5%的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上30-32°C，转速220r/min下培养6天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；
[0035]4)右旋糖酐酶的分离纯化:将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后再进行硫酸铵盐析以及琼脂糖凝胶柱分离，得到纯的右旋糖酐酶酶液，经上述DNS法测得酶活为650U/mL ；
[0036]5)右旋糖酐酶优先降解高分子右旋糖酐的特性:将步骤4)中得到的纯酶液与两种不同分子量右旋糖酐(底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw665?a)构成的双底物溶液进行混合，在25°C下催化反应，运用HPLC检测催化过程中两种底物的分子量变化，结果见图1，高分子量的底物E优先被降解，分子量不断降低，而低分子量的底物F在反应初期基本无变化，从而证实本发明公开的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有优先降解高分子右旋糖酐的特性。
[0037]实施例3
[0038]棘孢青霉F1008在制备低分子右旋糖酐中的应用:
[0039]在电动机械搅拌装置和水浴控温的烧杯中加入240g蔗糖与2000mL的缓冲溶液，搅拌充分溶解后，控制水浴温度在30°C，同时加入4000U的右旋糖酐蔗糖酶与5000U的右旋糖酐酶，搅拌反应22-24小时，然后将水浴温度升至80°C保温I小时灭活右旋糖酐蔗糖酶，纱布过滤变性酶蛋白后再置于沸水浴中20分钟灭活残留的右旋糖酐酶，再经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为低分子右旋糖酐溶液。
[0040]该溶液经70°C旋蒸浓缩去除部分水分，浓缩至原体积一半后进行分级醇沉，得到总收率为71%的三种分子量的右旋糖酐，分别为13.7%11258Da，35.5%8510Da,
21.8%5272Da，三种产品的分子量分布宽度指数分别为1.39，1.26，1.14。实施例4:
[0041]棘孢青霉 F1008在制备低分子右旋糖酐中的应用:
[0042]在电动机械搅拌装置和水浴控温的烧杯中加入120g蔗糖与2000mL的缓冲溶液，搅拌充分溶解后，控制水浴温度在30°C，同时加入4000U的右旋糖酐蔗糖酶与5000U的右旋糖酐酶，搅拌反应22-24小时，然后将水浴温度升至80°C保温I小时灭活右旋糖酐蔗糖酶，纱布过滤变性酶蛋白后再置于沸水浴中20分钟灭活残留的右旋糖酐酶，再经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为低分子右旋糖酐溶液。[0043]该溶液经70°C旋蒸浓缩去除部分水分，浓缩至原体积一半后进行分级醇沉，得到总收率为68.7%的两种分子量的右旋糖酐，分别为23.5%8000Da，45.2%4412Da，产品的分子量分布宽度指数分别为1.22，1.11。
[0044]实施例5:
[0045]棘孢青霉F1008在制备低分子右旋糖酐中的应用:
[0046]在电动机械搅拌装置和水浴控温的烧杯中加入600g蔗糖与2000mL的缓冲溶液，搅拌充分溶解后，控制水浴温度在30°C，同时加入6000U的右旋糖酐蔗糖酶与6000U的右旋糖酐酶，搅拌反应26小时，然后将水浴温度升至80°C保温I小时灭活右旋糖酐蔗糖酶，纱布滤过变性酶蛋白后再置于沸水浴中20分钟灭活残留的右旋糖酐酶，再经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为低分子右旋糖酐溶液。
[0047]该溶液经70°C旋蒸浓缩去除部分水分，浓缩至原体积一半后进行分级醇沉，得到总收率为69.5%的三种分子量的右旋糖酐，分别为15.l%9831Da，36.6%6276Da，
17.8%350?a，三种产 品的分子量分布宽度指数分别为1.14，1.10，1.10。
【权利要求】
1.一种从土壤当中筛选分离得到的棘孢青霉F1008，该菌株由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8135。
2.权利要求1所述的棘孢青霉F1008在制备高酶活的右旋糖酐酶中的应用。
3.利用权利要求1所述的棘孢青霉F1008制备右旋糖酐酶的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行: 1)菌株活化:采用灭菌固体PDA培养基，将F1008菌株接种在试管斜面上，28-30°C下培养48-60h,然后用于菌株种子液制备； 2)菌株种子发酵培养:种子培养基组分为每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g,蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g, KC10.05g, FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，将步骤I)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上30-32°C，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶； 3)发酵制备右旋糖酐酶:发酵培养基组分为每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g，蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g, KC10.05g, FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按5%的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上30-32°C，转速220r/min下培养5天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化，得到纯的右旋糖酐酶。
4.利用权利要求1所述的棘孢青霉F1008菌株发酵制得的右旋糖酐酶制备低分子右旋糖酐的方法，其特征在于:采用市售右旋糖酐蔗糖酶与棘孢青霉F1008右旋糖酐酶联合作用于蔗糖溶液制备系列低分子量的右旋糖酐，其制备方法包括以下步骤: 将蔗糖溶于PH5.0浓度0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，在25°C下同时添加市售右旋糖酐蔗糖酶与棘孢青霉F1008右旋糖酐酶，恒温搅拌反应22-26小时，再将反应体系置于80°C下保温I小时灭活右旋糖酐蔗糖酶，过滤变性酶蛋白后再置于沸水浴中20分钟灭活残留的右旋糖酐酶，再经过滤得到清澈透明的滤液，即为低分子右旋糖酐溶液，将所述低分子右旋糖酐溶液进行70°C旋蒸浓缩、无水乙醇分级醇沉以及真空干燥，最后得到系列低分子量右旋糖酐产品； 所述的低分子右旋糖酐指的是重均分子量为10000Da、6000-8000Da、3000-5000Da的低聚右旋糖酐； 所述的蔗糖:乙酸-乙酸钠缓冲溶液:右旋糖酐蔗糖酶:右旋糖酐酶的比例为60-200g:1OOOmL:2000-3000U:2500_7500U。
【文档编号】C12N1/14GK103834574SQ201410003338
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】张洪斌, 甘微苇, 张宇琪, 胡雪芹 申请人:合肥工业大学