用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及其应用。本发明所提供的用于鉴定黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素的引物由如下2个引物对组成：序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。实验证明，本发明所提供的用于鉴定黄曲霉菌株是否产毒的引物序列特异性高，PCR扩增鉴定具有速度快，可信度度高等特点，为快速、准确、高通量筛选不产毒黄曲霉菌株提供了很好的技术手段，对控制农产品中黄曲霉毒素的污染具有十分重要的意义。
【专利说明】用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及其应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxins)是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌产生的次级代谢产物,在我国,黄曲霉毒素主要由黄曲霉产生。黄曲霉毒素具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡，其主要的作用靶标是肝脏，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)的主要因素之一,最短24周内就能够导致肝脏坏死癌变等，此外还可以引起肾脏和肾上腺的急性病变。因此，有效防控黄曲霉毒素污染，对于保障我国食品安全和维护国家经济利益具有重要意义。
[0003]不同黄曲霉菌株在产黄曲霉毒素能力上有很大差异，其中不产毒黄曲霉可以占到0%-80%。最近，利用不产毒黄曲霉来抑制产毒黄曲霉的生长从而控制农产品中黄曲霉毒素的含量在美国、非洲等国家和地区得到了较好的应用。可见，如何鉴定黄曲霉是否产毒是非常重要的。目前，对黄曲霉是否产毒主要是先培养黄曲霉菌株，然后再提取毒素，最后对毒素含量进行检测，非常费时费力。因此，开发一种快速鉴定黄曲霉是否产毒的方法对于筛选不产毒黄曲霉， 从而控制农产品中黄曲霉毒素的污染具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及其应用。
[0005]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物对组，具体由如下2个引物对组成:序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。
[0006]黄曲霉毒素主要是由黄曲霉3号染色体内一个70kb左右基因簇上的29个基因参与其合成与调控的。研究表明不产毒黄曲霉主要是由于其毒素合成基因缺失造成的。其中，所述引物对I特异于af IR基因；所述引物对2特异于hypB基因。
[0007]在所述引物对组中，每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用。
[0008]含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0009]本发明的另一个目的是提供所述引物对组的制备方法。
[0010]所述引物对组的制备方法，具体可包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0011]本发明的还一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。
[0012]所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤:将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后,与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内:PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
[0013]所述引物对组，或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素中的应用，或在制备用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0014]本发明的再一个目的是提供一种利用所述引物对组，或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的方法。
[0015]该方法具体可包括如下步骤:
[0016](1)从待测黄曲霉菌株中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对组中的2个引物对分别进行PCR扩增，得到2份PCR产物；
[0017](2 )根据步骤(1)所得2份PCR产物，按照如下方法确定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素:若所述2份PCR产物中目的DNA片段的数目小于2个，则所述待测黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素，或候选不产黄曲霉毒素；若所述2份PCR产物中目的DNA片段的数目为2个，则所述待测黄曲霉菌株产黄曲霉毒素，或候选产黄曲霉毒素；
[0018]所述目的DNA片段为如下任一:利用所述引物对I扩增得到的大小为629bp的DNA片段；利用所述引物对2扩增得到的大小为422bp的DNA片段。
[0019]在步骤(1)中，采用所述2个引物对分别进行PCR扩增时采用的退火温度均为55。。。
[0020]在所述方法的步骤(1)中，进行所述PCR扩增的反应条件具体为:95°C预变性2min ;94°C变性 30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 lmin30s, 30 个循环；最后 72°C延伸 7min。[0021 ] 在所述方法的步骤(1)中，在进行所述PCR扩增的每个反应体系中，所述引物对中每条单链DNA分子的终浓度均可为0.2-0.5 μ M，具体如0.5 μ Μ。
[0022]进一步，进行所述PCR扩增的反应体系具体为:模板I μ L，10 μ M的上下游引物各I μ L(终浓度均为 0.5 μ Μ), 2 X Colorless GoTaq?.Reaction Buffer 10 μ L,补双蒸水 7 μ L至 20 μ L 体系。其中，2XColorless GoTaq ? Reaction Buffer Gotag 为美国 promega 公司产品，其产品目录号为M7132。
[0023]在所述方法中，所述大小为629bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列5所示；所述大小为422bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列6所示。
[0024]在本发明中，所述待测黄曲霉菌株具体为如下中的任一种:黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-12> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-14> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-1K 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-27、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-33、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-19> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-14、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-1> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) JZ-2、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-17> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-5> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-6> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-15、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-24、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-10> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-12、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-24> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-15> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) FX-1 和黄曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-9。
[0025]在本发明中，以上所有的所述黄曲霉毒素均可为如下中的至少一种:黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2。
[0026]实验证明，本发明提供了用于鉴定黄曲霉菌株是否产毒的引物序列，这些序列特异性高，通过利用该引物序列PCR扩增鉴定产毒黄曲霉和不产毒黄曲霉，具有速度快，可信度度高等特点，为快速、准确、高通量筛选不产毒黄曲霉菌株提供了很好的技术手段，对控制农产品中黄曲霉毒素的污染具有十分重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为特异性检测各菌株PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
[0028]图2为黄曲霉毒素BpByGpG2混合标准品的HPLC图谱。其中，I为黄曲霉毒素标准品中AFG2，保留时间为7.861min ；2为黄曲霉毒素标准品中AFG1，保留时间为8.793min ；3为黄曲霉毒素标准品中AFB2,保留时间为10.293min ；4为黄曲霉毒素标准品中AFB1,保留时间为 11.735min。
[0029]图3为不产毒黄曲霉菌株DW-12发酵滤液的HPLC图谱。
[0030]图4为产毒黄曲霉菌株DW-5发酵滤液的HPLC图谱。
[0031]图5 为不产毒黄曲霉菌株 DW-12、XinZ-11、XinZ-27 和 QD-1 的 C3，aflT, norA 和hypA四个基因PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
【具体实施方式】
[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]黄曲霉菌(Aspergillusflavus)菌株 DW-12、DW-14、XinZ-ll、XinZ-27、XinZ_33、YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2、GZ-17，以及 DW-5、DW-6、XinZ-15、XinZ-24、YC-10、HG-12、HG_24、QD-15、FX-1、GZ-9:记载于“张初署.2013.中国四个生态区花生土壤中黄曲霉菌分布、产毒特征及遗传多样性研究[D]博士学位论文.北京:中国农业科学院农产品加工研究所”一文，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。
[0035]黄曲霉毒素Bp B2、G2混合标准品(LB96951):购于SUPELC0公司。
[0036]实施例1、用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物的设计与合成
[0037]根据毒素合成基因af II^PhypB的序列，设计2组PCR引物，分别为af lR-F/af IR-R和hypB-F/hypB-R。具体如表1所示。引物由上海生工合成，也可通过常规的引物合成方法合成。
[0038]表1不同毒素合成基因引物序列
[0039]
【权利要求】
1.用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物对组，由如下2个引物对组成:序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于:所述引物对组中，每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用。
3.含有权利要求1或2所述引物对组的试剂盒。
4.权利要求1或2所述引物对组的制备方法，其特征在于:所述制备方法包括将权利要求I或2所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
5.权 利要求3所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤:将权利要求1或2所述的引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内=PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
6.权利要求1或2所述引物对组，或权利要求3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素中的应用，或在制备用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的产品中的应用。
7.利用权利要求1或2所述引物对组，或权利要求3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤: (1)从待测黄曲霉菌株中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的引物对组中的2个引物对分别进行PCR扩增，得到2份PCR产物； (2)根据步骤(1)所得2份PCR产物，按照如下方法确定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素:若所述2份PCR产物中目的DNA片段的数目小于2个，则所述待测黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素，或候选不产黄曲霉毒素；若所述2份PCR产物中目的DNA片段的数目为2个，则所述待测黄曲霉菌株产黄曲霉毒素，或候选产黄曲霉毒素； 所述目的DNA片段为如下任一:利用所述引物对I扩增得到的大小为629bp的DNA片段；利用所述引物对2扩增得到的大小为422bp的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:在步骤(1)中，采用所述2个引物对分别进行PCR扩增时采用的退火温度均为55°C。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述大小为629bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列5所示；所述大小为422bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列6所示。
10.根据权利要求1-9中任一所述的引物对或试剂盒或方法或应用，其特征在于:所述待测黄曲霉菌株为如下中的任一种:黄曲霉菌(Aspergillus flavus) DW-12、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-14> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-1K 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-27、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-33、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-19> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-14> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-1> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) JZ-2、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-17> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-5> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-6> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-15、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-24、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-10> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-12> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-24> 黄曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-15、黄曲霉菌(Aspergillus flavus) FX-1 和黄曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-9。`
【文档编号】C12N15/11GK103725783SQ201410003175
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】周露, 刘阳, 魏丹丹, 张初署, 邢福国, 赵月菊, 王龑 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所