一种脆江蓠尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，具体是一种脆江蓠尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，该基因核苷酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别为SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。本发明通过基因克隆技术克隆出基因序列，构建原核表达载体，通过对重组蛋白进行酶活性检测，证实了其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的功能，属于琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖等合成途径的关键酶编码基因。该基因对于提高藻类琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖等经济成分含量具有重要的应用价值。
【专利说明】一种脆江蓠尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因
【技术领域】[0001]本发明涉及一种脆江蓠尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。特别涉及一种脆江蓠(Gracilaria chouae)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的核苷酸序列,及其编码蛋白以及在合成淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖等的能力和在改良重要经济成分和抗逆性状中的应用。
【背景技术】
[0002]克隆产物合成相关基因并验证其功能，揭示基因与产物之间的关系，辅助开展品种改良已成为国际农业育种领域提高经济成分含量的有效途径之一；同时，利用基因工程技术生产活性物质与经济产物已成为现代生物技术产业发展的核心内容。
[0003]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase,UDP-glucose pyrophosphorylase)是生物糖代谢过程中一个关键酶，在植物以及藻类中主要催化反应Glc-1-P + UTP —— UDPG +PPi，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化反应的产物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG，uridinediphosphate glucose)作为体内主要活化糖的形式,可作为葡萄糖基供体参与琼胶、鹿糖、纤维素、半纤维素、海藻糖、果胶质、胼胝质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢。
[0004]海洋藻类是自然界中琼胶、淀粉、纤维素等重要经济资源产物的主要原料之一。尤其是以红藻为主要原料的琼胶可广泛应用于各种食品和药物领域。
[0005]琼胶、蔗糖、纤维素、半纤维素、海藻糖、果胶质、胼胝质以及糖脂、糖蛋白等不同物质的生物合成途径不同，但都是以尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)催化反应的产物尿苷二磷酸葡萄糖(W)PG)作为共有的初始反应底物。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)催化活力直接影响到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的含量水平，因此，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)被认为是一类重要的关键酶。
[0006]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)广泛存在于各种生物体内，如绿色植物(Green Plants)、高等动物(Animals)、娃藻(Diatom)、绿藻(Green algae)、褐藻(Brownalgae)、红藻(Red algae)、真菌(Fungi)、细菌(Bacteria)等。目前，已经在大量绿色植物和微生物中克隆出该酶的基因并验证了其功能，但在藻类中该基因的克隆开展的还不多，仅有日本凋毛藻(Griffithsia japonica)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )、龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)、江蓠(Gracilaria gracilis)得至Ij了克隆，但并未验证该基因编码酶的功能。
[0007]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)催化反应的产物之一尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作为合成蔗糖、纤维素、半纤维素、果胶质等经济成分的初始底物，使绿色植物成为提取上述物质的主要原料。同时，在合成重要海藻胶-琼胶的生物合成中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)被认为是红藻糖苷合成过程中的限速酶，控制着重要的产物UDP-D-葡萄糖的合成，对于提高红藻中的琼胶含量具有重要的价值。目前，植物中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的功能验证主要通过检测其催化逆反应UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，但于红藻、褐藻中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的克隆十分缺乏,并且其功能仍未得到确认。
【发明内容】
[0008]针对目前现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其可编码一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶蛋白，所述蛋白具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，该基因的应用可用于提高琼胶、蔗糖、纤维素、半纤维素、海藻糖、果胶质、胼胝质以及糖脂、糖蛋白等含量。
[0009]本发明的目的之一在于提供一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，所述基因是从脆江蓠(Gracilaria chouae)中分离出来的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因,命名为GcUGP ;所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示。
[0010]本发明的目的之二在于提供一种所述基因编码的蛋白，所述蛋白由SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其具有可逆催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性。
[0011]本发明目的之三是所述基因及其编码蛋白在合成琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖中的应用。
[0012]本发明目的之四是所述基因及其编码蛋白在改良经济成分性状以及在进行发酵工程中的应用。
[0013]本发明通过基因克隆的方法，从脆江蓠中克隆到了一个尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，并通过实验证明了其编码的蛋白具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，是合成琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖的关键基因。克隆和分析脆江蓠尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因有助于深入理解脆江蓠等红藻琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖合成机制，同`时也会为相关产物基因工程和分子育种提供了基因资源。本发明首次从脆江蓠(Gracilaria chouae)中分离到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，并通过原核表达载体对重组蛋白进行酶活性检测，证实了其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性功能，具有琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖基因工程和分子育种的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明的GcUGP基因cDNA全长的PCR扩增图。
[0015]图2为本发明的GcUGP基因及其编码氨基酸序列(方框中分别为起始密码子和终止密码子)。
[0016]图3为本发明的GcUGP基因转化pET32a载体后PCR检测阳性克隆PCR扩增图(I泳道为pET32a用BamHI和NotI双酶切产物；2泳道为脆江蓠UGPase基因转化pET32a载体用BamHI和NotI双酶切产物；M为DNA标准分子量)。
[0017]图4为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物纯化后SDS-PAGE检测图。
[0018]图5为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物的Western-Blot检测图。
[0019]图6为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物的不同温度对酶活性的检测图。
[0020]图7为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物的pH对酶活性的检测图。[0021]图8为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物的不同金属离子对酶活性的检测图。
[0022]图9为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物的不同底物浓度酶活性变化图。
[0023]图10为本发明的GcUGP基因转化大肠杆菌BL21表达产物的不同底物浓度双倒数曲线图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南(Sambrook J, et al.2008.Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3rd Ed.)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0025]实施例1:基因全长编码区的克隆与分析
[0026]脆江蓠采集自广东省汕头市，采集时间为2011年8月。采用Trizol法提取脆江蓠抱子体总 RNA,使用 TAKARA公司 PrimeScript IIlst Strand cDNA Synthesis试剂盒以脆江蓠孢子体总RNA反转录的第一链cDNA为模板，采用Touchdown PCR技术进行脆江蓠GcUGP基因的CDS全长序列的扩增，扩增引物包括2组(5' -TAGAATTCATGAATCGCGACTCCAGCTC-3'和5' -TGCGGCCGCTTAATGCGG AATCAC-3' ；5' -TAGAATTCATGAATCGCGACTCCAGCTCG-3'和5' -AGCGGCCGCATGCGGAATCACATG-3' )。PCR 扩增程序为:94°C 3min ；94°C 30s,60°C 30s,72°C 2min，15个循环，每个循环退火温度降低1°C ；94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 2min,20个循环；72°C IOmin0 PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，于_20°C保存。回收的目的片段，于16°C金属浴过夜连接至克隆载体PMD19-T，并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli ToplO中，涂布于含有100mg/mL Amp的LB固体培养基上，37°C过夜培养，经过IPTG/X-gal蓝白斑筛选后，挑取4-10个阳性克隆进行测序。将测序结果通过序列比对，分离到了一个脆江蓠UGP基因，命名为GcUGP。GcUGP CDS序列全长为1488bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，编码496个氨基酸，以ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
[0027]实施例2 =GcUGP编码蛋白的制备及分析
[0028]脆江蓠GcUGP PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切下目的条带，琼脂糖凝胶回收，回收产物GcUGP和pET32a质粒进行BamHI和NotI双酶切，在37°C金属浴3-4h后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将目的片段GcUGP和质粒pET32a进行连接，16°C过夜，构建好的重组质粒命名为pET32a_GcUGP。
[0029] 将重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21，挑取BL21阳性克隆，摇菌并保存菌株。PCR检测重组子。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶图像分析仪成像。挑取电泳检测插入条带正确的克隆测序，检测有无突变，移码框是否改变。
[0030]将成功连接了目的片段的BL21菌株，以按照1:1000比例(IOml LB液体培养基+IOul AP+1OuI菌液)摇菌培养，每隔一个小时测OD值，直到0D600nm值达到0.6 (3_4h)。用0.1mM的IPTG浓度诱导菌液，诱导条件为25°C，160rpm，诱导6_8h。诱导结束后取2ml菌液4°C 12000rpm5min离心，弃上清，将管倒置于吸水纸上；沉淀加入1/2体积提前预冷好的IXPBS (PH=7.5)中(即2ml离心后的沉淀中加入lmllXPBS)，充分混匀。超声法破碎菌液，收集破碎后的上清液，用0.45 um的滤膜过滤，Ni柱纯化后，收集的蛋白样品放入透析袋中透析，以除去不需要的离子，获得重组GcUGP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，釆用SDS-PAGE、Westem-Blot检测重组蛋白的表达。
[0031]实施例3:GcUGP编码蛋白的功能验证
[0032]UGP 酶活测定:反应体系如下:100mMl X PBS，0.85mM UDPGj 0.5mM PPij 5mMMgcl2，0.3mM NADPj 5unit PGM, 5unit GDH和适量实施例2制备的重组GcUGP蛋白，总的反应体系为lmL，加入底物M-6-P起始反应。将上述除去底物的体系混合后在相应温度条件下孵育2min后起始反应，以相应的缓冲液为空白对照，在340mn处分别测定反应0min、6min和12min吸光值的变化，每个反应设置4个平行样。经检测，酶活为487.16U/g，对UDPG的Km为1.67umol，最适反应温度为40°C，最适pH为8.0。该酶为高温酶，碱性蛋白；Mg2+、Ca2+、Mn2+和Zn2+可以促进酶活，Pb2+、Cu2+抑制其活性。
[0033]目前UGP酶相关的基因及蛋白在一些植物和细菌中得到了检测，例如细菌 Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus (参见非专利文献:Ma Z, Fan HJj LuCP.Molecular cloning and analysis of the UDP—Glucose Pyrophosphorylase inStreptococcus equi subsp.zooepidemicus.Mol Biol Rep.2011Apr;38(4):2751-60.)，细菌 Sphingomonas paucimobilis (参见非专利文献:Marques AR，FerreiraPB，Sd-Correia I，Fialho AM.Characterization of the UgpG gene encoding aUDP-glucose pyrophosphorylase from the gelIan gum producer Sphingomonaspaucimobilis ATCC31461.Mol Genet Genomics.2003Mar;268(6):816-24.)，细菌 Mycobacterium tuberculosis (参见非专利文献:Lai X, Wu J, Chen S，ZhangX，Wang H.Expression,purification,and characterization of a functionalIyactive Mycobacterium tuberculosis UDP-glucose pyrophosphorylase.ProteinExpr Purif.2008Sep; 61 (I): 50-6.)，植物大麦(barley)(参见非专利文献:DeckerD，Meng M，Gornicka A，Hofer A, Wilczynska M, Kleczkowski LA.Substrate kineticsand substrate effects on the quaternary structure of barley UDP-glucosepyrophosphorylase.Phytochemistry.2012Jul; 79: 39-45.);但其各自的酶活性都远远小于本研究分析的海带UGP基因，上述几种UGP酶与本发明制备的UGP酶的Km值对比如下:
[0034]
【权利要求】
1.一种编码脆江蓠中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，其具有可逆催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的功能。
3.权利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白在合成琼胶、淀粉、纤维素、海藻糖、蔗糖等中的应用。
4.权利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白在改良经济成分性状以及在进行发 酵工程中的应用。
【文档编号】C12N15/55GK103710366SQ201410003074
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】刘涛, 池姗 申请人:中国海洋大学