一种培育转基因耐干旱植物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种培育转基因耐干旱植物的方法，首先构建含有SEQ?ID?NO：3的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。本发明将目的基因导入到正常植物体内高表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱的转基因植物。
【专利说明】一种培育转基因耐干旱植物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因工程【技术领域】，尤其是一种培育转基因耐干旱植物的方法。【背景技术】[0002]干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，提高植物尤其是农作物品种的抗逆性，成为植物遗传研究及作物品种改良的重要任务之一 (Bartels et al., 2005;Vinocur et al.，2005)。
[0003]在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力(Wang et al.，2003)。
[0004]在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。植物体对胁迫信号的响应过程体现在多个水平和层次上，其中激素的调节是一个重要的方面。ABA是一种重要的激素，除了参与植物体生长发育外，ABA在干旱，盐及冷等非生物胁迫过程中有重要的调节作用。在环境胁迫中，植物体产生大量的ABA，通过ABA信号转导，调苄基因表达而响应环境胁迫。多个蛋白因子参与ABA信号转导，其中PP2C蛋白家族是重要的负调节因子。PP2C是一类磷酸酶，能够抑制下游蛋白激酶SnRK2.2的活性。已有的研究结果提出的ABA信号转导的模式认为，在没有ABA时，PP2C蛋白能够和SnRK2.2结合并且抑制其激酶活性，从而阻断ABA信号转导；而在ABA存在时，ABA与其受体PYR/PRL家族结合，形成的受体复合物能够结合PP2C蛋白，从而解除对下游SnRK2.2蛋白的抑制作用，SnRK2.2蛋白能够磷酸化bZIP类转录因子，启动响应基因的表达(Ma等，2009 ;Park等，2009 ;Hubbard等，2010 ；Umezawa等，2009)。在这个过程中，对PP2C蛋白的活性调节是一个重要的过程。HABl基因编码一个PP2C蛋白，HABl能够通过可变剪切产生两个剪切体HAB1.1和HAB1.2，HAB1.1编码一个511个氨基酸的蛋白，能够直接和SnRK2.2结合并抑制其激酶活性，从而抑制ABA信号2编码一个406个氨基酸的部分蛋白，缺失C端105个氨基酸。目前尚没有关于HAB1.2功能及应用的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种培育转基因耐干旱植物的方法，将目的基因导入到正常植物体内高表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱的转基因植物。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0007]一种培育转基因耐干旱植物的方法，使序列表中SEQ ID NO:1所示蛋白质的编码基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
[0008]作为本发明的一种优选技术方案，序列表中SEQ ID NO:2所示的基因通过点突变处理以保留其中的内含子序列，使突变后的基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
[0009]作为本发明的一种优选技术方案，序列表中SEQ ID NO:2所示的基因通过点突变处理获得SEQ ID NO:3所示的目的基因，使SEQ ID NO:3在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
[0010]作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO:3的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
[0011]作为本发明的一种优选技术方案，以过表达双兀载体为载体构建重组表达载体。
[0012]作为本发明的一种优选技术方案，将SEQ ID NO:3所示的目的基因插入到过表达双元载体PCAMBIA1300的限制性内切酶的BamH I和Kpn I酶切识别位点之间，得到重组表达载体，命名为 pCAMBIA1300-HABl.2pm。
[0013]作为本发明的一种优选技术方案，利用重组表达载体转化农杆菌获得转化体，然后再利用农杆菌介导的蘸花法转化目的植物，筛选阳性植株，经过多代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
[0014]作为本发明的一种优选技术方案，培育转基因耐干旱植物的操作步骤包括:
[0015]A、克隆序列表中SEQ ID NO:2所示的基因HAB1.2:
[0016]A-1、提取野生 植株的总RNA，以此RNA为模板，反转录成cDNA ；
[0017]A-2、根据SEQ ID NO:2所示基因的序列设计引物对，引物末端分别引入Kpn I和BamH I酶切识别位点:
[0018]HAB1.2-F:5，-GGGTACCC ATGGAGGAGATGACTCCCG-3，，见 SEQ ID NO:4 ；
[0019]HAB1.2-R:5’ -CGGATCC TCAGGTTCTGGTCTTGAACTTTC-3’，见 SEQ ID NO:5 ；
[0020]利用此引物对以步骤A-1中合成的cDNA为模板PCR扩增SEQ ID NO:2所示基因，PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1.66Kb左右的条带；
[0021]B、SEQ ID NO:2所示的HAB1.2基因通过点突变获得SEQ ID NO:3所示目的基因HAB1.2pm:
[0022]B-1、将步骤A所得DNA条带连接在T-载体上；
[0023]B-2、设计下列引物对:
[0024]HABlmutantF:5，-GTCCATCATTAAGCATTGCTTC-3，，见 SEQ ID NO:6 ；
[0025]HABlmutantR:5，-CTAGACATGGCGAGAACACC-3，，见 SEQ ID NO:7 ；
[0026]以步骤B-1中测序正确的载体为模板，通过试剂盒点突变构建载体HAB1.2pm_T:
[0027]C、将突变目的基因插入双元载体构建重组表达载体:
[0028]C-1、以步骤B所得HAB1.2pm_T为模板、步骤A-2中的HAB1.2-F和HAB1.2-R为引物扩增HAB1.2pm,回收PCR产物并连接T-载体，测序；
[0029]C-2、用限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切步骤C_1得到的中间载体及质粒PCAMBIA1300，回收基因片段和载体骨架；
[0030]C-3、连接上步所得的基因片段和载体骨架，连接产物通过电击法转化DH5a菌株，过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组表达载体PCAMBIA1300-HAB1.2pm,此重组表达载体为在质粒pCAMBIA1300的Kpn I和BamH I酶切位点之间插入了 SEQ ID NO:3所是的基因HAB1.2pm ；[0031]D、转化体的构建:
[0032]D-1、将步骤C所得重组表达载体pCAMBIA1300-HABl.2pm与置于甘油中农杆菌GV3101混匀后冷却，1.5V电压电击，LB液体培养基28°C、300rpm培养I小时；
[0033]D-2、将步骤D-1中的培养基涂LB板，28°C静置培养2天，挑阳性克隆得到重组农杆菌；
[0034]E、农杆菌介导的蘸花法获取转基因植株:
[0035]E-1、将步骤D所得重组农杆菌接种于LB液体培养基中，28°C、300rpm培养获取菌液；
[0036]E-2、将带花的植株连同花盆一起倒扣在盛有农杆菌菌液的容器中，使植株的花浸泡20-40S，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T1代种子，潮霉素筛选阳性植株；T2代为T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代为T2代自交产生的种子及由它所长成的植株；将T3代植株中突变体表型恢复野生型表型的植株在DNA和cDNA水平进行鉴定，鉴定的引物为步骤A-2中的HAB1.2F和HAB1.2R，从阳性植株中筛选得到转基因植株，即转HAB1.2pm植株。
[0037]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
[0038]本发明的基因在ABA诱导的条件下高表达，通过基因工程技术将此基因转移到作物中并进行过表达可以显著提高作物对干旱的抗性。没有点突变的基因片段在植物体内将被剪切为HAB1.1，但是研究发现过表达HAB1.1没有抗旱表型，本发明在转基因应用前首先对目的基因进行点突变修饰，使得其内含子不被剪切，从而保证该转基因片段以HAB1.2的形式存在于植物体。参看下文实施例中记载的试验，在干旱胁迫环境下培育，相对野生型植株的成活率为40%，两个导入本发明基因的转基因株系的成活率分别为68%和72% ;转基因技术已经成为提高作物抗逆性的主要途径，本发明为提高作物的抗干旱性提供了重要的基因资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为实施例1中HAB1.2受胁迫诱导表达的Real-time PCR图表；5天拟南芥小苗用100 μ M的ABA处理O及3小时后取样，检测基因表达。
[0040]图2为相对野生型和过表达ΗΑΒ1.2基因突变体的抗旱性比较；
[0041]Α，转化ΗΑΒ1.2植物体中ΗΑΒ1.2表达检测，其中“habl_l”为对照，“2_11”和“8-14”为两个转基因样本；
[0042]B，上部左一，干旱处理21天的相对野生型(habl-1);上部右一、右二，过表达HAB1.2植株；下部:复水5天后相对野生型和过表达HAB1.2植株。
【具体实施方式】
[0043]本发明序列表SEQ ID NO:2所示的基因命名为:HAB1.2，其突变体SEQ ID NO:3，命名为HAB1.2pm ；SEQ ID NO:1为SEQ ID NO:3基因所表达的蛋白质。
[0044]以下实施例详细说明了本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0045]可用现有的植物表达载体构建含有上述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物基因枪转化法所用的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如烟草花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 [0046]实施例1、实时定量Real-time PCR分析HAB1.2基因的表达特性
[0047]一、胁迫处理
[0048]取室温生长5d左右的野生型进行以下处理:将生长在MS培养基上5天的拟南芥取出置于添加100 μ M的脱落酸(ABA)的MS培养基上光照培养0，3h后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0049]二、mRNA 的分离
[0050]用试剂盒Plant/Fungi RNA Purification Kit (购自 Norgen 公司)按说明书提取步骤一中经处理的材料的RNA。
[0051]三、反转录为cDNA
[0052]以步骤二中所提RNA为模板，反转录成cDNA。
[0053]四、定量Real-time PCR
[0054]将cDNA用作定量Real-time PCR的模板，用基因特异引物对对样品进行Real-time PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以ACTIN2做内参，Real-time PCR试验设3次重复；结果如图1所示，基因HAB1.2在ABA处理3小时后表达明显升高，这说明HAB1.2是一个受ABA诱导表达的基因。
[0055]实施例2、转基因耐旱植株的培育
[0056]一、表达载体构建
[0057]LHAB1.2基因的克隆
[0058]①用试剂盒Plant/Fungi RNA Purification Kit (购自 Norgen)按说明书提取拟南芥野生性Col-O的RNA，以此RNA为模板，反转录成cDNA。
[0059]②根据HAB1.2基因的序列设计引物对，弓丨物末端分别引入Kpn I和BamH I酶切识别位点，以①中合成的cDNA为模板PCR扩增HAB1.2基因；[0060]HABl.2-F: 5’ -GGGTACCCATGGAGGAGATGACTCCCG-3’，见 SEQ ID NO:4 ；
[0061]HABl.2-R:5’-CGGATCCTCAGGTTCTGGTCTTGAACTTTC-3’，见 SEQ ID NO:5 ；
[0062]PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳,采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0 (TaKaRa 公司，Code N0.:DV807A)回收纯化 1.66Kb 左右的条带。
[0063]2.点突变
[0064]①将上述DNA条带连接在T-载体上。
[0065]②设计下列引物，以①中测序正确的载体为模板，用TaKaRa公司MutanBEST Kit进行点突变构建载体HABl.2pm-T ；
[0066]HABlmutantF:5' -GTCCATCATtaagcattgcttc-3，，见 SEQ ID NO:6 ；
[0067]HABlmutantR:5，-CTAGACATGGCGAGAACACC-3，，见 SEQ ID NO:7 ；
[0068]3、将点突变基因插入双元载体构建重组表达载体
[0069]①以HABl.2pm_T 为模板，HABl.2-F 和 HABl.2-R 为引物扩增 HABl.2pm,回收 PCR
产物并连接T-载体，测序；
[0070]②用限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切步骤I得到的中间载体及pCAMBIA1300，回收基因片段和载体骨架并进行连接；
[0071]③将连接产物电击转化DH5a菌株(购自Takara公司)，37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA1300-HABl.2pm(在pCAMBIA1300的Kpn I和BamH I酶切位点之间插入了突变后的HAB1.2的⑶S片段)。
[0072]二、转化植株的获得
[0073]①将步骤I得到的pCAMBIA1300-HABl.2pm质粒约3 μ g与置于甘油中农杆菌GV3101 50 μ I混匀后冷却，1.5V电压电击I秒钟，加Iml LB液体培养基28°C、300rpm培养I小时。
[0074]②将步骤I中的培养基涂LB板(含50mg/ml利福平，50mg/ml卡那霉素)，28°C静置培养2天；挑阳性克隆得到重组农杆菌。
[0075]③将重组农杆菌接种于3mL LB (含50mg/ml利福平,50mg/ml卡那霉素)液体培养基中，28°C、300rpm培养约16小时；
[0076]④所得菌液转至200mL LB (含50mg/ml利福平,50mg/ml卡那霉素)中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.2-2.0)；
[0077]⑤收集菌体，4 °C、4000g离心lOmin，用含10%蔗糖MS液体培养基(含
0.02%silwet)稀释至 0D600 约为 0.8-1.0 ；
[0078]⑥将拟南芥突变体habl-Ι整株与花盆一起倒扣在盛有菌液的容器中，使花浸泡30s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T1代种子，潮霉素筛选(浓度为25μ g/L潮霉素)阳性植株。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T3代植株中突变体表型恢复野生型表型的植株在DNA和cDNA水平进行鉴定(鉴定的引物为2F和HABl.2R ；)。从阳性植株中筛选得到转基因植株(转 HABl.2pm 植株)。
[0079]三、转基因植株(转HABl.2pm植株)的耐旱性鉴定
[0080]参看附图2的b部分，将正常生长的21天的相对野生型habl-Ι (左一)，和上述得到的转基因植株(转HABl.2pm植株)(右一、右二)不浇水，干旱处理约15天；观察其存活情况。从图中可知，和其背景habl-Ι相比，转基因植株耐旱最强；实验重复3次，结果显示在干旱胁迫下，对照突变体habl-Ι的存活率为40%，转化HABl.2pm突变体的存活率分别为68%和72%，显示本发明的转基因植株具有高耐旱性。
[0081]上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制 条件。
【权利要求】
1.一种培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:使序列表中SEQ ID N0:1所示蛋白质的编码基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:序列表中SEQID NO:2所示的基因通过点突变处理以保留其中的内含子序列，使突变后的基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
3.根据权利要求2所述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:序列表中SEQID NO:2所示的基因通过点突变处理获得SEQ ID NO:3所示的目的基因，使SEQ ID NO:3在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
4.根据权利要求1或2或3所述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:首先构建含有SEQ ID NO:3的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
5.根据权利要求4所 述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:以过表达双元载体为载体构建重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于^fSEQID N0:3所示的目的基因插入到过表达双元载体PCAMBIA1300的限制性内切酶的BamH I和Kpn I酶切识别位点之间，得到重组表达载体，命名为pCAMBIA1300-HABl.2pm。
7.根据权利要求4所述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:利用重组表达载体转化农杆菌获得转化体，然后再利用农杆菌介导的蘸花法转化目的植物，筛选阳性植株，经过多代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高耐干旱性的转基因植物。
8.根据权利要求1或2或3所述的培育转基因耐干旱植物的方法，其特征在于:其操作步骤包括: A、克隆序列表中SEQID NO:2所示的基因HAB1.2: A-1、提取野生植株的总RNA，以此RNA为模板，反转录成cDNA ； A-2、根据SEQ ID NO:2所示基因的序列设计引物对，引物末端分别引入Kpn I和BamHI酶切识别位点:
HAB1.2-F:5’-GGGTACCC ATGGAGGAGATGACTCCCG-3’，见 SEQ ID NO:4 ；
HAB1.2-R:5’ -CGGATCC TCAGGTTCTGGTCTTGAACTTTC-3’，见 SEQ ID NO:5 ； 利用此引物对以步骤A-1中合成的cDNA为模板PCR扩增SEQ ID NO:2所示基因，PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1.66Kb左右的条带； B、SEQID NO:2所示的HAB1.2基因通过点突变获得SEQ ID NO:3所示目的基因HAB1.2pm: B-1、将步骤A所得DNA条带连接在T-载体上； B-2、设计下列引物对:
HABlmutantF:5’ -GTCCATCATTAAGCATTGCTTC-3’，见 SEQ ID NO:6 ；
HABlmutantR:5，-CTAGACATGGCGAGAACACC-3，，见 SEQ ID NO:7 ； 以步骤B-1中测序正确的载体为模板，通过试剂盒点突变构建载体HAB1.2pm-T: C、将突变目的基因插入双元载体构建重组表达载体: C-1、以步骤B所得HAB1.2pm-T为模板、步骤A-2中的HAB1.2-F和HAB1.2-R为引物扩增HAB1.2pm,回收PCR产物并连接T-载体，测序；C-2、用限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切步骤C-1得到的中间载体及质粒PCAMBIA1300,回收基因片段和载体骨架； C-3、连接上步所得的基因片段和载体骨架，连接产物通过电击法转化DH5a菌株，过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组表达载体PCAMBIA1300-HAB1.2pm，此重组表达载体为在质粒pCAMBIA1300的Kpn I和BamH I酶切位点之间插入了 SEQ ID NO:3所是的基因HAB1.2pm ； D、转化体的构建: D-1、将步骤C所得重组表达载体pCAMBIA1300-HABl.2pm与置于甘油中农杆菌GV3101混匀后冷却，1.5V电压电击，LB液体培养基28°C、300rpm培养I小时； D-2、将步骤D-1中的培养基涂LB板，28°C静置培养2天，挑阳性克隆得到重组农杆菌； E、农杆菌介导的蘸花法获取转基因植株: E-1、将步骤D所得重组农杆菌接种于LB液体培养基中，28°C、300rpm培养获取菌液； E-2、将带花的植株连同花盆一起倒扣在盛有农杆菌菌液的容器中，使植株的花浸泡20-40S，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T1代种子，潮霉素筛选阳性植株；T2代为T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，Τ3代为T2代自交产生的种子及由它所长成的植株；将T3代植株中突变体表型恢复野生型表型的植株在DNA和cDNA水平进行鉴定，鉴定的引物为步骤A-2中的HAB1.2F和HAB1.2R，从阳性植株中筛选得到转基因植株，即转HAB1.2pm植株。
【文档编号】C12N15/82GK103725701SQ201410003143
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】王志娟, 李霞 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心