一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途
【专利摘要】本发明涉及一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途。棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂制备方法包括耐砷活性保持培养、纯化培养、摇瓶种子培养、发酵种子培养、控制发酵与后处理等步骤。本发明棘孢木霉菌厚垣孢子具有高的抗逆境能力，其粉剂受环境温度、酸碱度等影响小，环境中不同砷浓度水平对厚垣孢子萌发无明显影响。因此，棘孢木霉菌厚垣孢子具有很强的生命力，在土壤中存活时间很长，明显促进土壤中砷的挥发，减少土壤中砷的总量，从而可以有效地修复受砷污染的土壤。本发明的方法能够缩短大量生产棘孢木霉菌厚垣孢子所需的时间，显著地降低了棘孢木霉菌厚垣孢子生产成本，有利于该技术推广应用。
【专利说明】一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途
【【技术领域】】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】。更具体地，本发明涉及一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉齐?，还涉及所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法，还涉及所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的用途。
【【背景技术】】
[0002]木霉菌(Trichoderma spp.)是一类土壤中普遍存在的腐生真菌,其生长快、生物量大。木霉菌在其生长周期内可以产生三种繁殖体，包括菌丝体、厚垣孢子和分生孢子，目前生产实际中常用的木霉菌剂多为它的活分生孢子制剂，如以色列开发的哈茨木霉T39可湿性粉剂Trichodex,美国的Topshield(哈茨木霉T22)等。一些木霉菌常常可形成圆形或椭圆形的厚垣孢子，在基内菌丝上间生，或者在营养菌丝侧枝的尖端端生，其大小在7~12X 10_13 μ m,表面光滑，细胞壁有加厚现象，无性生殖产生，通常有耐不良环境条件的能力。厚垣孢子是木霉菌重要的繁殖体形式。木霉属厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生孢子，至少能存活20月。
[0003]在木霉菌的众多种类中，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)具有富集与转化砷功能、能忍耐高砷环境且生长良好。如Zeng等(Capability of Pentavalent ArsenicBioaccumulation and Biovolatilization of Three Fungal Strains under LaboratoryConditions, Clean-Soil Air Water, 2010, 38 (3), 238-241)报道的结果表明，棘孢木霉菌对环境中砷具有很高的耐受性，并且可将环境中砷累积于细胞内，同时将砷转化为易挥发的形态从而释放到大气中，进而减少环 境中砷的含量。因此，棘孢木霉菌可被用于砷污染环境的修复中。此外，木霉菌的生防能力也被大家广泛认同。
[0004]目前，许多研究者就对木霉的产孢条件进行了大量的摸索，以期高效地将该类木霉菌应用于生产实践中。从木霉菌分生孢子的产生条件来看，其在多种固体或液体培养基中都能够产生分生孢子，而且城市垃圾、腐败的咖啡果皮、禽类的粪便以及混以牛粪的咖啡果皮、香蕉叶、甘蔗渣和麦麸等廉价物质均可作为木霉菌的固体培养基来生产分生孢子，且孢子产量都可达IO9CFU/克左右。由此来看，木霉菌产生分生孢子的生产条件相对要求较低。
[0005]近年来，国内外研究发现T.harzianum, T.viride等木霉菌株在糖蜜一玉米衆等液体培养基中进行深层发酵15天左右可产生IO7数量级的厚垣孢子；在麦麸等、灭菌土壤、土壤浸出液及植物碎片等固体培养基中培养20天左右也可产生厚垣孢子达IO6数量级。总体来看，目前报道的各木霉菌厚垣孢子的发酵时间均较长(>15天)，且成本较高，发酵的产率较低，并且发酵后生成的部分厚垣孢子的活性或作用能力可能会降低或丧失。目前，国内外尚未见到具有富集与转化砷功能棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂制备的相关报道。所生产出的厚垣孢子如果以液态形式施用，不仅运输不方便、而且也易使菌剂受到污染；而厚垣孢子经制备成固态粉剂后，不仅运输方便、菌剂受污染的几率大大减少，而且还利于储存、方便应用等，同时对提高菌株的活性和应用效果等具有良好作用。【
【发明内容】
】
[0006][要解决的技术问题]
[0007]本发明的目的是提供一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法。
[0009]本发明的另一个目的是提供所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的用途。
[0010][技术方案]
[0011]本发明是通过下述技术方案实现的。
[0012]本发明涉及一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法。
[0013]本发明使用的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存编号为CGMCC N0.3186，保存日期为2009年7月09日，具体参见申请日2012年09月26日、申请号201210361866.6、发明名称“一种棘孢木霉菌的筛选方法及其应用”的发明专利申请。
[0014]该制备方法的步骤如下:
[0015]A、耐砷活性保持培养
[0016]按照棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比1:45~55，将含菌量为1.0~9.9X104cfu/ml的棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的砷浓度为43~50mg/l的菌种培养基里，在温度26~30°C与摇床转速120~140rpm的条件下连续培养4~6天，待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积的1/2~2/3时，再从该瓶中取出棘孢木霉菌菌悬液在上述含砷的PGP培养基中在上述条件下进行培养，按照这种方式重复培养3~4次，得到含菌量为1.0~9.9X 104cfu/ml的、具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液。然后，按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比1:45~55，将该棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的无砷菌种培养基里，在温度26~30°C与摇床转速120~140rpm的条件下连续培养3~5天,待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积的1/2~2/3时结束纯化培养，得到含菌量为1.0~9.9X104cfu/ml的不含砷的，具有高耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液。
[0017]所述的菌种培养基(PGP)是按照下述方法制备得到的:
[0018]取20g削皮马铃薯在水中煮沸20分钟，榨汁，将得到的汁与1.0g葡萄糖、0.3g蛋白胨、2.0g琼脂与100ml水混合，将得到的混合物的pH值调节至6.8~7.2，灭菌后得到所述的菌种培养基，得到所述的菌种培养基。
[0019]在本发明中，采用的灭菌方法是本【技术领域】里常规灭菌方法。
[0020]根据本发明，含砷菌种培养基是按照本发明对砷浓度的要求，将含有V价砷的水溶性化合物溶于所述的菌种培养基(PGP)中所得到的菌种培养基。
[0021]在本发明中，所述的含有V价砷的水溶性化合物例如是砷酸钠、砷酸钾或砷酸钙，优选地是砷酸钠。
[0022]在本发明中，所述含砷菌种培养基的砷浓度优选地是45~48mg/l。
[0023]优选地，棘孢木霉菌 菌悬液与菌种培养基的体积比是1:48~52，更优选地是1:50。
[0024]在本发明中，使用的微生物培养摇床是本【技术领域】里通常使用的培养微生物的设备，是目前市场上销售的产品。
[0025]在本发明中，棘孢木霉菌丝体体积是采用微生物学实验常规方法[《微生物学实验技术》(合肥工业大学出版社，2009)、《微生物学实验》(科学出版社，2010)]测定的。
[0026]棘孢木霉菌的菌悬液的含菌量采用稀释平板计数法，该方法是微生物学实验操作中的常规方法(微生物学实验，科学出版社，2010)。
[0027]根据本发明，棘孢木霉菌在含砷的PGP培养基中重复培养的目的在于充分活化棘孢木霉菌对砷的耐受能力。然后于不含砷的PGP培养基中培养的目的在于去除棘孢木霉菌中可能含有的砷，同时保持其较高的耐砷活性。
[0028]B、摇瓶种子培养
[0029]按照纯化棘孢木霉菌的菌悬液与摇瓶种子培养基的体积比1:400~500，将步骤B得到的含菌量为1.0~9.9X 104cfu/ml的纯化棘孢木霉菌的菌悬液接种于装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在温度26~30°C与摇床转速160~180rpm的条件下连续培养28-32小时，待摇瓶中微生物进入其生长速度最快的指数生长期时结束培养，得到摇瓶种子。
[0030]所述的摇瓶种子培养是按照下述方法制备得到的:
[0031]将淀粉、葡萄糖、酵母粉与CaCO3按照重量比2.5:1.2:1.2:0.2溶于100重量份水中，然后进行湿热灭菌，得到所述的摇瓶种子培养。
[0032]湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌法以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法包括煮沸灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、流通蒸汽灭菌法和间歇蒸汽灭菌法。
[0033]在本发明中，进行湿热灭菌所采用的方法是高压蒸汽灭菌法，其具体条件是在温度121°C的条件下灭菌15分钟，湿热灭菌所使用的设备是本【技术领域】里通常使用的灭菌设备，例如是北京科林恒达科技有限公司的型号为致微GI80TR的高温灭菌锅。
[0034]C、发酵种子培养
[0035]将步骤B得到的摇瓶种子按照摇瓶种子与发酵种子培养基的体积比1:200~250接入发酵种子培养基中，在温度26~30°C与摇床转速160~180rpm的条件下连续培养25~30小时，得到发酵种子。
[0036]这个步骤的主要目的在于培养用于大量生产棘孢木霉菌厚垣孢子的发酵种子。
[0037]所述的发酵种子培养基是按照下述方法制备得到的:
[0038]将淀粉、葡萄糖、酵母粉与CaCO3按照重量比4:5:2:1溶于500重量份水中，将得到溶液的PH值调节至6.5~6.8，然后蒸汽灭菌，得到所述的发酵种子培养基。
[0039]发酵种子培养基的pH值可以使用无机酸或无机碱水溶液进行调节。无机酸例如是硫酸、盐酸或磷酸；无机碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。无机酸或无机碱水溶液的浓度一般是0.5-2.0N。
[0040]在本发明中，所述蒸汽灭菌的具体条件是在温度121°C的条件下灭菌15分钟。
[0041]本发明发酵种子培养所使用的设备是本【技术领域】里通常使用的种子培养设备，例如是金坛市城西富威实验仪器厂生产的型号为HZQ-A的大型气浴恒温摇床。
[0042]D、控制发酵[0043]在发酵罐中，按照以发酵培养基体积计6~10%接种量将步骤C得到的发酵种子接种到发酵培养基中在下述条件下进行控制发酵:
[0044]控制发酵温度:在控制发酵第O~20小时为26°C;在控制发酵第20~50小时为28°C，然后将发酵温度控制在26°C直到控制发酵结束；
[0045]通气量:以发酵培养基与空气体积比计，在控制发酵第O~15小时为1:0.6，在控制发酵第15~50小时为1:1，在控制发酵第50小时以后为1:0.6 ;
[0046]揽祥速度:160~180rpm。
[0047]所述的发酵培养基是按照下述方法制备得到的:
[0048]将淀粉、酵母粉、玉米浆、蛋白胨、CaCO3按照重量比16.5,11.0,22.0,16.5,2.05溶 于650重量份水中，将得到溶液的pH值调节至6.5~7.2，然后蒸汽灭菌，得到所述的发酵
培养基。
[0049]本发明控制发酵所使用的发酵罐是本【技术领域】里通常使用的发酵设备，例如是江苏丰泽生物工程设备制造有限公司生产的型号为FZ-D300L的发酵设备。
[0050]这个步骤的主要作用在于通过优化发酵过程，以便高效、大量地生产棘孢木霉菌厚垣孢子。
[0051]E、后处理
[0052]向步骤D中得到的控制发酵液中添加以控制发酵液总重量计3-6%硅藻土，再对该发酵液进行过滤，得到的厚垣孢子再自然风干，得到的固态厚垣孢子再使用研磨器进行研磨，得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。
[0053]使用硅藻土主要是用于提高发酵液中厚垣孢子的浓度，避免过滤过程中可能产生的厚垣孢子流失，此外，还可以提高过滤的速度，提高工作效率。
[0054]本发明对发酵液进行过滤的装置是本【技术领域】里通常使用的发酵设备，例如是上海钧鼎机械制造有限公司生产的450型铸铁板框式压滤机，
[0055]过滤后的棘孢木霉菌厚垣孢子平铺在滤纸上，让其在温度20~30°C下自然风干。
[0056]得到的固态厚垣孢子再使用本【技术领域】里通常使用的研磨器进行研磨，得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。
[0057]本发明还涉及采用所述制备方法所得到的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。所述的粉剂只含有厚垣孢子，所述厚垣孢子的含量是8.3X108cfu/g以上。
[0058]利用无菌水将本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂稀释，然后使用光学显微镜进行计数分析，同时采用稀释平板计数分析，分析结果表明所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉的厚垣孢子含量达到8.3X 108cfu/g。通过显微镜分析还发现，本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子粉全部为厚垣孢子，无其它类型的孢子成分。以上方法均是微生物学实验操作中的通过方法，具体地可以参见《微生物学实验技术》(合肥工业大学出版社，2009)、《微生物学实验》(科学出版社，2010)。
[0059]另外，将本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂研磨至100目，然后使用能谱仪(EDS)对其粉末样品进行了元素含量分析，具体分析条件如下:
[0060]美国热电Thermo-VG Scientific公司的ESCALAB250型能谱仪；测定条件:样品平铺于专用样品架上，待达到真空后，利用仪器进行元素相对含量分析，数据采用仪器配置的专用软件进行分析。[0061]元素含量分析结果列于下表1中。由表1可见，本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的碳、氧、氮、钾、钠、钙、磷、硫等元素含量，具有典型的生物体元素含量特征(参见〈微生物学〉，高等教育出版社，2009年出版)。
[0062]表1:棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂元素含量分析结果
【权利要求】
1.一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下: A、耐砷活性保持培养 按照棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比1:45~55，将含菌量为1.0~9.9X104cfu/ml的棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的砷浓度为43~50mg/l的菌种培养基里，在温度26~30°C与摇床转速120~140rpm的条件下连续培养4~6天，待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积的1/2~2/3时，再从该瓶中取出棘孢木霉菌菌悬液在上述含砷的PGP培养基中在上述条件下进行培养，按照这种方式重复培养3~4次，得到含菌量为1.0~9.9X 104cfu/ml的、具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液；然后，按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比1:45~55，将该棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的无砷菌种培养基里，在温度26~30°C与摇床转速120~140rpm的条件下连续培养3~5天,待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积的1/2~2/3时结束纯化培养，得到含菌量为1.0~9.9X104cfu/ml的不含砷的，且具有较高耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液； B、摇瓶种子培养 按照纯化棘孢木霉菌的菌悬液与摇瓶种子培养基的体积比1:400~500，将步骤B得到的含菌量为1.0~9.9X 104cfu/ml的纯化棘孢木霉菌的菌悬液接种于装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在温度26~30°C与摇床转速160~180rpm的条件下连续培养28-32小时，待摇瓶中微生物进入其生长速度最快的指数生长期时结束培养，得到摇瓶种子； C、发酵种子培养 将步骤C得到的摇瓶种子按照摇瓶种子与发酵种子培养基的体积比1:200~250接入发酵种子培养基中，在温度26~30°C与摇床转速160~180rpm的条件下连续培养25~30小时，得到发酵种子； D、控制发酵 在发酵罐中，按照以发酵培养基体积计6~10%接种量将步骤C得到的发酵种子接种到发酵培养基中在下述条件下进行控制发酵: 控制发酵温度:在控制发酵第O~20小时为26°C;在控制发酵第20~50小时为28°C，然后将发酵温度控制在26 °C直到控制发酵结束； 通气量:以发酵培养基与空气体积比计，在控制发酵第O~15小时为1:0.6，在控制发酵第15~50小时为1:1，在控制发酵第50小时以后为1:0.6 ; 搅拌速度:160~180rpm ； E、后处理 向步骤D中得到的控制发酵液中添加以控制发酵液总重量计3-6%硅藻土，再对该发酵液进行过滤，得到的厚垣孢子经自然风干，得到的固态厚垣孢子再使用研磨器进行研磨，得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述的菌种培养基是按照下述方法制备得到的: 取20g削皮马铃薯在水中煮沸20分钟，榨汁，将得到的汁与1.0g葡萄糖、0.3g蛋白胨、2.0g琼脂与100ml水混合，将得到的混合物的pH值调节至6.8~7.2，灭菌后得到所述的菌种培养基，得到所述的菌种培养基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的砷是砷酸钠、砷酸钾或砷酸钙。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤B中，所述的摇瓶种子培养是按照下述方法制备得到的: 将淀粉、葡萄糖、酵母粉与CaCO3按照重量比2.5:1.2:1.2:0.2溶于100重量份水中，然后进行湿热灭菌，得到所述的摇瓶种子培养。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述的发酵种子培养基是按照下述方法制备得到的: 将淀粉、葡萄糖、酵母粉与CaCO3按照重量比4:5:2:1溶于500重量份水中，将得到溶液的PH值调节至6.5~6.8，然后蒸汽灭菌，得到所述的发酵种子培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，所述的发酵培养基是按照下述方法制备得到的: 将淀粉、酵母粉、玉米浆、玉米浆、蛋白胨、CaCO3按照重量比16.5、11.0、22.0、16.5、2.05溶于650重量份水中，将得到溶液的pH值调节至6.5~7.2，然后蒸汽灭菌，得到所述的发酵培养基。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤E中，所述的过滤方法为板框压滤法。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤E中，所述的自然风干温度是20 ~30?。
9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述制备方法所得到的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂，其特征在于所述的粉剂只含有厚垣孢子，所述厚垣孢子的含量是8.3X108cfu/g以上。
10.根据权利要求9所述的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂在修复被砷污染的土壤中的用途。
【文档编号】C12N3/00GK103740634SQ201410003169
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】曾希柏, 蒋细良, 苏世鸣, 王秀荣, 李莲芳, 白玲玉, 王亚男, 段然, 吴翠霞 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 中国农业科学院植物保护研究所