专利名称：一种通用型rna干扰载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA干扰载体及其构建方法和应用，特别涉及一种通用型的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
RNA干扰(RNAinterf erence，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。在动物中，RNAi可以通过U6启动表达shRNA来实现。目前的U6载体可以通过2种方式表达在动物细胞内表达:瞬时表达以及稳定表达。shRNA是由长度为50 70个核苷酸的单链分子产生的具有茎环结构的特殊小分子RNA。其结构特点是:5 10个核苷酸的环连接两条19 29个核苷酸的互补长链RNA片段，这两条片段通过碱基配对形成茎环结构。shRNA可以通过化学合成和体外转录合成在体外产生，但最典型的方式是通过PolIII的启动子在体内表达产生。紧随19 29nt靶基因反向互补序列之后连上5 6个T作为RNA聚合酶的转录终止子。
发明内容
本发明是结合亚克隆技术与RNA干扰(RNAi)技术所发明的新型通用型RNAi载体。为了使hU6启动子的使用更加方便，并且提高oligoDNA的连接效率。本发明通过改造hU6启动子的3 ‘端的核苷酸序列，产生可用的限制性酶切位点粘性末端。并且在载体上设计可以作为部分转录终止子可用碱基的酶切位点序列。本实验成功改造hU6启动子序列，所表达的shRNA无多余核糖核苷酸，成`功抑制目标基因的表达；改造后的U6启动子结合亚克隆技术、转录终止子，使得U6启动子的使用更加方便、节约了时间，降低了成本，可以提高RNA干扰技术在一般实验室的普及应用。为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段:本发明的一种通用型RNA干扰载体，从5’端开始，包括以下依次相连的各部分:含有PCMV启动子的绿色荧光蛋白、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点。其中多克隆酶切位点用于线性化质粒，暴露用于连接oligoDNA的粘性末端 ’人U6启动子以及终止子用于表达目的shRNA ;绿色荧光蛋白用于观测质粒转染效率；PCMV-NE0:用于筛选具有稳定RNAi作用的单克隆细胞；复制起始位点(Origin)提供载体在大肠杆菌中的复制信息；AmP Promoter-AmP用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖。在本发明中，优选的，所述的U6启动子序列是以质粒i a V-PENTR/U6为模板，通过使用以下引物扩增得到的:
F:5’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R:5， -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，；所述的多克隆酶切位点与终止子序列是自行设计合成的核苷酸序列，核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。在本发明中，优选的，所述的载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。进一步的，本发明还提供了一种构建以上任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包 括以下步骤:(I)突变型人U6启动子的构建以含人U6启动子的载体为模板，使用点突变后的引物PCR扩增得到突变型人U6启动子，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-U6。扩增引物为:F:5’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R: 5 ’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，；(2)绿色荧光蛋白(GFP)的构建以含可以完整表达绿色荧光蛋白元件的载体为模板，扩增得到含有PCMV、GFP、SV40P0LY (A)的表达元件，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-GFP。扩增引物为:F:5， -TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’R:5’ -TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’ ；(3)正筛选基因的构建新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子以载体PGT-Vl为模板进行克降，NEO的扩增引物为:F:5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5， -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3，；PCMV启动子的扩增引物为:F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；(4)骨架载体的构建合成多克隆位点，并将其亚克隆到PUC57载体上，构建骨架载体TOC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID N0.2或图2所示；(5)元件组装①利用PUC57-MCS上的AgeI与ClaI两个酶切位点以及载体PMD20_T_hU6上的AgeI与ClaIdf hU6亚克隆至PUC57-MCS构建成为载体roC57_hU6 ；②PCMV与NEO基因的组装:将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，利用PCMV-NEO上的BamH1、NheI以及PUC57-hU6上的BglII，SpeI将PCMV-NEO克隆到载体PUC57_hU6上，构建成为载体PUC57-UN ；③利用PMD57-UN上的AgeI与SalI以及PMD20-T-GFP上的XmaI与SalI位点，将GFP克隆到PUC57-UN上，构建成为目的载体PGN_hU6。在本发明中，优选的，步骤(I)中构建得到的含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段的序列如SEQ ID N0.3所示。更进一步的，本发明还提供了以上任一项所述的RNA干扰载体在构建猪源细胞RNAi表达载体中的应用。在使用本发明的载体构建猪源细胞RNAi表达载体时，包括以下步骤:1、双酶切载体，暴露PGN_hU6上的U6启动子与终止信号之间的粘性末端。2、合成转录shRNA所需的DNA序列,符合本载体的ds_oligo (DNA)如图4所示；3、将合成的片段与酶切后的PGN_hU6连接，转化连接产物，挑取阳性克隆测序验证，测序引物为:5’ -G GACTATCATATGCTTACCG-3’。 4、大量获得阳性菌液，大提质粒。6、脂质体转染细胞，观测载体对于目的蛋白的抑制效率。
·
本发明的干扰载体实现了不同操作情况下，对细胞基因表达的瞬时抑制或者稳定抑制，在建立稳定表达细胞系时，提高了转然后载体的整合效率.同时通过对hU6启动子进行改造，引入了 2个酶切位点，线性化载体可以连接任意的目标oligoDNA，此oligoDNA仅含有2个额外核苷酸(即，不用于表达shRNA的核苷酸)，节省了试验成本。
图1为重组载体PGN-U6的载体图谱；图2为重组载体PUC57-MCS的载体图谱；图3为PCMV与NEO的连接片段；图4为符合本载体的ds-oligo (DNA)示意图；图5为不同时间检测绿色突光信号图；图6为转染阳性质粒细胞及空转染细胞中α V的mRNA水平比较；
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1 一种通用型RNA干扰载体的构建方法1、实验材料i a V-PENTR/U6载体:本实验室参照文献《Lentviral-mediated RNAi to inhibittarget gene expression of the porcine integrin av subunit, the FMDV receptor,and against FMDV infection in PK_15cells〉〉构建；pcDNA3.1/CT-GFP 载体:购自 invitrogene 公司；PGT-Vl:本实验室参照文献《双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定》构建；多克隆酶切位点，实验中用到相关引物:由上海生物工程有限公司合成；试验中用到的各种试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，另限制性内切酶购自NEB公司(应用于载体酶切的内切酶购自宝生物)。2、方法2.1载体的构成载体的构成如PGN-U6结构图谱图1所示，其功能介绍如下:ClaI, Sfi1:用于酶切暴露U6启动子与终止信号之间的粘性末端，便于插入目的ds oligo:hU6启动子、终止子:用于表达目的shRNA ；PCMV-GFP:用于观测质粒转染效率；PCMV-NEO:用于筛选具有稳定RNAi作用的单克隆细胞；PUC Origin:载体在大肠杆菌中的复制信息；AmP Promoter-amP:用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖；Nru1、Srf1:用于转染前，线性化载体；2.2载体基因原件的克隆2.2.1突变型人U6启动子(hU6)的构建以i a V-PENTR/U6载体为模板扩增突变型人U6启动子，所使用的扩增引物为:F: 5 ’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R: 5 ’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，。扩增长度为289bP,扩增程序为:94 °C Imin,55 °C 50s,72 °C 3min(30cycles)；72°C 3min(over)。将克隆得到的片段连接到载体PMD20-T上得到载体PMD20_T_hU6，进行测序验证，克隆得到突变型人U6启动子片段，序列如SEQ ID N0.3所示。通过上述引物对产生可由ClaI酶切 位点酶切后产生粘性末端的突变型人U6启动子。所改造碱基为ATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG 中的 ￡ 点突变为 T。2.2.2绿色荧光蛋白(GFP)的构建以质粒pcDNA3.1/CT-GFP为模板扩增GFP表达元件，所使用的引物为:F:5， -TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’R:5， -TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3，；扩增长度为1600bP,扩增程序为:94 °C Imin,53 °C 50s、72C2min(30cycles)；72°C 5min (over)。将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，进行测序验证，克隆得到GFP表达元件，序列如SEQ ID N0.4所示，构建得到PMD20-T-GFP。2.2.3正筛选基因的构建正筛选基因(新霉素抗性基因ΝΕ0)以及PCMV启动子以载体PGT-Vl为模板进行克隆。NEO的扩增引物为:F:5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5， -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3，；其扩增程序为94°C lmin>59°C 50s>72°C lmin30s (30cycles) ；72°C 8min (over)；长度为1226bP。PCMV的扩增引物为:F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3’ ；其扩增程序为94°C lmin、57°C 50s、72°C Imin (30cycles) ；72°C 8min (over);长度为615bP，PCMV与NEO的连接片段如图3所示。2.2.4骨架载体的构建本实验根据所得到各个基因原件的基因序列，设计不存在于这些基因上的酶切位点的多克隆位点，将多克隆位点送上海生工合成，并由上海生共将其亚克隆到TOC57载体上，构建骨架载体TOC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID N0.2，PUC57-MCS载体图谱如图2所示。2.3元件组装通过如下步骤进行基因的亚克隆将各基因原件组装到骨架载体PUC57-MCS上。(I)利用PUC57-MCS上的AgeI与ClaI两个酶切位点以及载体PMD20_T_hU6上的AgeI与ClaIdf hU6亚克隆至PUC57-MCS构建成为载体roC57_hU6 ；⑵PCMV与NEO基因的组装:将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，利用PCMV-NEO上的BamH1、NheI以及PUC57-hU6上的BglII，SpeI将PCMV-NEO克隆到载体PUC57_hU6上，构建成为载体PUC57-UN ；(3)利用 PUC57-UN 上的 AgeI 与 SalI 以及 PMD20-T-GFP 上的 XmaI 与 SalI 位点，将GFP克隆到PUC57-UN 上，构建成为目的载体PGN_hU6，并且进行测序验证，载体图谱如图1所示，载体的序列如SEQ ID N0.1所示。各个亚克隆步骤中每个载体所使用的限制性内切酶及反应条件如表I所示。表I各个亚克隆步骤中每个载体所使用的限制性内切酶及反应条件
权利要求
1.一种通用型RNA干扰载体，其特征在于，所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分:含有PCMV启动子的绿色荧光蛋白、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点；所述的通用型RNA干扰载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.构建权利要求1所述的通用型RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)突变型人U6启动子的构建 以含人U6启动子的载体为模板，使用点突变后的引物PCR扩增得到突变型人U6启动子，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-hU6 ;扩增引物为:F:5’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R:5’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ ； (2)绿色荧光蛋白(GFP)的构建 以含可以完整表达绿 色荧光蛋白元件的载体pcDNA3.1/CT-GFP为模板，扩增得到含有PCMV, GFP、SV40P0LY(A)的表达元件，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-GFP ;扩增引物为:F:5’ -TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3，R:5’ -TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’ ； (3)正筛选基因的构建 新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子以载体PGT-Vl为模板进行克隆，NEO的扩增引物为:F:5’ -ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3’R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ； PCMV启动子的扩增引物为:F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’R:5’ -GTT CCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3’ ； (4)骨架载体的构建 合成多克隆位点，并将其亚克隆到PUC57载体上，构建骨架载体TOC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID N0.2所示； (5)元件组装 ①利用roC57-MCS上的SalI与ClaI两个酶切位点以及载体PMD20_T_hU6上的SalI与ClaIdf hU6亚克隆至PUC57-MCS构建成为载体roC57_hU6 ； ②PCMV与NEO基因的组装:将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，将PCMV-NEO克隆到载体PUC57_hU6上，构建成为载体 PUC57-UN ； ③利用PMD57-UN上的AgeI与SalI以及PMD20-T-GFP上的XmaI与SalI位点，将GFP克隆到PUC57-UN上，构建成为目的载体PGN-hU6。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)①中构建得到的含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段的序列如SEQ ID N0.3所示。
4.权利要求2-3任一所述的方法构建的通用型RNA干扰载体在构建猪源细胞RNAi表达载体中的应 用。
全文摘要
本发明公开了一种通用型RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分绿色荧光蛋白、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点。本发明的干扰载体实现了不同操作情况下，对细胞基因表达的瞬时抑制或者稳定抑制，在建立稳定表达细胞系时，提高了转然后载体的整合效率.同时通过对hU6启动子进行改造，引入了2个酶切位点，线性化载体可以连接任意的目标oligoDNA，此oligoDNA仅含有2个额外核苷酸(即，不用于表达shRNA的核苷酸)，节省了试验成本。
文档编号C12N15/64GK103160532SQ20131005178
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月2日 优先权日2013年2月2日
发明者常惠芸, 马延滨, 独军政, 邵军军, 高闪电, 赵付荣, 丛国正, 林彤 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所