前列腺癌标志物spink1及其应用的制作方法

专利名称：前列腺癌标志物spink1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供用于癌症研究、癌症诊断和癌症治疗的组合物和方法，包括(但不限于)提供癌症标志物。尤其，本发明提供前列腺癌的SPINKl标志物和其他标志物。
背景技术：
前列腺癌是美国男性最常见的非皮肤性癌症，并且是患癌症死亡的第二大原因。在过去15年，已记入美国和英国的癌症登记库的前列腺癌的数目显著增长。该变化主要表明被确诊癌症的数目增长而非患癌人数的实际增长。在2006年，大概出现234，460名新增病例以及27，350个死亡病例。经判定，这些新增病例中大约91%的患者被确诊为处于局部化或局部扩散期(local or regional stages)。前列腺癌(PCa)的经典诊断方式是直肠指诊检测和/或前列腺特异性抗原(PSA)筛选。血清PSA水平的增高可能标志着PCa的存在。因为PSA只能由前列腺细胞分泌，所以PSA被用作前列腺癌的标志物。健康的前列腺产生的PSA量稳定，一般在4ng/mL以下(或PSA读数少于等于4)，而癌细胞产生的PSA量随着癌症严重程度的增加而增加。水平在4-10之间可引起医生怀疑病人有前列腺癌，而高于50的量可能意味着肿瘤已经扩散到身体其他部位。 当PSA或直肠指诊检测显示极为可能存在癌症时，将用直肠超声(TRUS)法来定位前列腺并显示任何可疑区域。使用前列腺各个部位的活组织检查来确定前列腺癌是否存在。治疗的选择取决于癌症分期。预期寿命为10年或10年以内、Gleason评分较低、肿瘤还未扩散到前列腺以外的患者常常采取观察等待法(不治疗)。对更具侵袭性的癌症治疗的选择包括:手术治疗法，如根治性前列腺切除术(RP)，其中前列腺完全切除(使用或不使用神经保留术)；和放射治疗法，其通过外粒子束从体外将剂量导向前列腺或者通过在前列腺中植入低剂量的放射性粒子杀死局部的癌细胞。也单独或联合手术治疗法或放射治疗法使用激素疗法。激素疗法应用黄体生成素释放激素(LH-RH)类似物来阻断垂体生成促进睾丸激素生成的激素。病人的余生都必须注射LH-RH类似物。虽然手术或激素治疗通常对局部PCa有效，但晚期疾病仍然基本上无法治愈。雄激素切除法是晚期PCa最常用的治疗方式，这导致大量的雄激素依赖性恶性细胞发生凋亡，肿瘤暂时消退。然而在大多数情况下，肿瘤发生猛烈地复发并能产生不依赖雄激素信号的增殖。PSA筛选法的出现使得可以更早地检测出PCa，明显降低了 PCa相关的死亡率。PSA筛选法目前是前列腺癌唯一最好的检测方法，广泛应用于前列腺癌的诊断，但是它无法帮助确认检测出的癌症是否将引起具有临床意义的疾病。尽管PSA对已经确诊前列腺癌的随诊患者是很好的标志物，然而一些前列腺癌患者的PSA水平可能是正常的。PAS水平中度升高(4-10ng/mL)对前列腺癌具有低特异性，且PSA水平的升高并非前列腺癌所特有。高血清PSA水平也可能与前列腺炎、前列腺梗塞、PIN、前列腺活组织检查、经尿道前列腺切除术和尿道导管插入有关。由于PSA筛选法的局限性，人们通过使用一些衍生指标(如PSA密度、年龄相关的PSA水平、TZ - PSA密度、PSA速率、游离PSA水平、复合PSA(cPSA)测定值和游离PSA与总PSA的比率)来努力提高其诊断特异性。游离PSA与总PSA的比率计量结合PSA和游离PSA在总PSA中所占百分比，其是癌症和良性肿瘤病理学又一有用的鉴定指标，特别是PSA水平中度升高(4-10ng/mL)的患者的鉴定。这个比率对确认PSA中度升高的患者在初始系统活组织检查的结果为阴性的情况下重复作活组织检查是否适合也很有用。游离PSA的百分比越低，癌症的可能性越高。因此，研究开发血清和组织中其他生物标志物来补充PSA筛选法是必要的。

发明内容
本发明提供了一种鉴定患者体内的前列腺癌的方法，包括:提供取自患者的包含前列腺细胞的样品；在包含前列腺细胞的样品内检测相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达；以及在包含前列腺细胞的样品内检测ERG和/或ETVl的正常表达，其中，在包含前列腺细胞的样品内检测与ERG和/或ETVl的正常表达相比互斥的SPINKl的过度表达，从而鉴定患者体内的前列腺癌。在一些实施方案中，检测步骤包括检测SPINKl RNA的过度表达。在其他实施方案中，检测步骤包括检测SPINKl蛋白的过度表达。在一些实施方案中，包含前列腺细胞的样品是前列腺组织、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或者分离的前列腺细胞。在一些实施方案中，在包含前列腺细胞的样品内检测SPINKl的过度表达来鉴定患者体内的侵入性前 列腺癌。在一些实施方案中，包含前列腺细胞的样品取自进行根治性前列腺切除术后的患者，并且SPINKl的过度表达鉴定前列腺癌在进行根治性前列腺切除术后的患者体内复发。本发明进一步提供了一种鉴定患者体内的前列腺癌的方法，包括:提供取自患者的包含前列腺细胞的样品；以及在包含前列腺细胞的样品内检测:(a)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达和相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达；(b)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达和相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达；(c)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在；⑷相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达和相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达；(e)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在；(f)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在；或(g)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达、相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在，其中，在包含前列腺细胞的样品内检测SPINKl的过度表达来鉴定患者体内的前列腺癌。在一些实施方案中，检测步骤包括检测SPINKl RNA的过度表达。在其他实施方案中，检测步骤括检测SPINKl蛋白的过度表达。在一些实施方案中，包含前列腺细胞的样品是前列腺组织、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或者分离的前列腺细胞。另外，本发明提供一种组合物，包括以下中的至少一项:(a)包含与SPINKl RNA或cDNA特异地杂交的序列的第一寡核苷酸探针、包含与ERG RNA或cDNA特异地杂交的序列的第二寡核苷酸探针、和包含与ETVl RNA或cDNA特异地杂交的序列的第三寡核苷酸探针；(b)第一对扩增性寡核苷酸，其中在第一对扩增性寡核苷酸中每个扩增性寡核苷酸均包含与SPINKl RNA或cDNA特异地杂交的序列，第二对扩增性寡核苷酸，其中在第二扩增性寡核苷酸对中每个扩增寡核苷酸均包含与ERG RNA或cDNA特异地杂交的序列，和第三对扩增性寡核苷酸，其中每个扩增性寡核苷酸均包含与ETVl RNA或cDNA特异地杂交的序列；或(c)与SPINKl蛋白特异地结合的第一抗体、与ERG蛋白特异地结合的第二抗体、和与ETVl蛋白特异地结合的第三抗体。本发明进一步提供了一种组合物，包括以下中的至少一项:(a)至少两种寡核苷酸探针，包括:(i)寡核苷酸探针，其包含与SPINKl RNA或cDNA特异地杂交的序列；和(ii)至少另一种寡核苷酸探针，其包含与PCA3 RNA或cDNA、G0LPH2 RNA或cDNA、或嵌合RNA或cDNA的接点(其中嵌合RNA的5’部分转录自TMPRSS2，嵌合RNA的3’部分转录自ERG基因)特异地杂交的序列；(b)至少两对扩增性寡核苷酸，包括:(i)、一对扩增性寡核苷酸，其中每个扩增性寡核苷酸均包含与SPINKl RNA或cDNA特异地杂交的序列；和(ii)至少另一对扩增性寡核苷酸，其中每个扩增性寡核苷酸均包含与PCA3 RNA或cDNA特异地杂交的序列、每个扩增性寡核苷酸均包含与G0LPH2RNA或cDNA特异地杂交的序列、或者第一扩增性寡核苷酸包含与转录自TMPRSS2或其相应cDNA的嵌合RNA的5’部分特异地杂交的序列并且第二扩增寡核苷酸包含与转录自ERG或其相应cDNA的嵌合RNA的3’部分特异地杂交的序列；或(c)至少两种抗体，包括:(i)与SPINKl蛋白特异地结合的抗体；和(ii)至少另一种与如下蛋白特异地结合的抗体:G0LPH2蛋白、天然ERG蛋白、由TMPRSS2基因和ERG基因的融合体编码的氨基端截断的ERG蛋白、或具有由TMPRSS2基因编码的氨基末端部分和由ERF基因编码的羧基末端部分的嵌合蛋白。本发明描述了附加的实施方案。


图1示出meta COPA鉴定了 SPINKl为前列腺癌中与ERG与ETVl互斥的异常值。a、通过研究的号码对基因进行排列，在研究中任意三个预定义的百分点分割处(75th、90th、95th)它们的分值都在前100个异常值中(由COPA排列)。对排列前100个基因，根据决定其排名的研究中它们的平均COPA等级(Avg.Rank)进一步进行排列。b、在两项SPINKl被排为前100个COPA异常值的研究中显示出SPINKl的表达和ERG对SPINKl与ETVl对SPINKl表达的散布图。在两个研究中散布图显示出所有样品的ERG对SPINKl (中间部分)和ETVl对SPINKl (底部部分)。图2示出SPINKl的过度表达，其鉴定了侵入性EST阴性的前列腺癌亚群并可以通过无创性的方式检测。a_b、两支群组(密西根大学(University of Michigan(UM))和瑞典观察等待中心(Swedish Watchful Waiting(Sffff)))用免疫组织化学法(IHC)评价了曾经以荧光原位杂交法(FISH)评价TMRPSS2:ERG状态的组织芯片的SPINKl表达。a、显示了代表性的SPINKl阳性和阴性中心和来自对于由FISH重排的TMRPSS2:ERG是阴性和阳性的同一中心的细胞。b、显示了 SPINKl表达和TMRPSS2:ERG状态以及两支群组Fisher精确检验的P值的列联表。c_e、SPINKl异常表达和外科切除术后生化指标复发之间的关系。Kaplan-Meier分析了(c)来自Glinsky等人的DNA芯片数据集的异常的SPINKl表达和来自(d)UM和(e)纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter (MSKCC))群组的SPINKl IHC检测并显示了外科切除术后的生化指标复发。f、无创性检测TMRPSS2:ERG阴性的前列腺癌患者的SPINKl异常表达。列联表示出SPINKl的异常表达和TMRPSS2:ERG的状态以及Fisher精确检验的p值。图3示出SPINKl在22RV1前列腺癌细胞中的的抑制(knockdown)削弱了癌症的侵袭性。a-b、如图所示SPINKl或LACZ腺病毒感染良性无限增殖前列腺细胞系RWPE，并且检验了该细胞系RWPE的(a)增殖或(b)穿过改良基底膜的侵袭。C、qPCR用于检测SPINK1、ERG和ETVl的异常表达。d-f、SPINKl介导22RV1细胞的侵袭性。检验了细胞的(d)增殖和
(e)侵袭。用所示siRNA处理的侵入的细胞的显微照片在f中示出。g、VCaP(TMPRSS2:ERG阳性)和g) LNCaP (ETV1重排阳性)的前列腺癌细胞系仅用转染试剂(未处理)处理，或如图所示用相对于SPINKl、ETVl或ERG非靶向性核酸或siRNA转染，并且检验侵袭。图4示出在良性前列腺组织和ETS阳性前列腺癌中荟萃异常基因(meta-outliergene)的过度表达。a、根据图1所示样品类别，所指研究显示荟萃异常基因ORM(列为4级)和NEB (列为7级)在标准化表达单元中的表达，揭示了多个良性样品中的异常表达。b、两项研究中所有定型样品的第三级荟萃异常基因GPRl 16 (左边部分)的表达和GPRl 16对ERG(右边部分)的散布图显示了 GPR116和ERG在多个样品中的共同异常表达。图5示出在DNA芯片研究中的相较于良性前列腺组织的前列腺癌中SPINKl的过度表达和与ERG和ETVl互斥的SPINKl的过度表达。5项研究图谱分析了前列腺组织的独特类型(a)和2项研究图谱分析了作为多发性癌的一部分的前列腺癌(b)，该五项研究和两项研究的SPINKl的过度表达和SPINKl对ERG与SPINKl对ETVl的散布图(如果检测)在图5中示出。图6示出与良性前列腺组织相比的前列腺癌中SPINKl的过度表达和与ERG和ETVl互斥的SPINKl的过度表达。a、示出通过qPCR研究了 10例良性前列腺样品、54例局部前列腺癌(PCa)和7例转移性(Met)PCa样品而作出的ERG对SPINKl (左边部分)与ETVl对SPINKl (右边部分)的散布图。图7示出在22RV1细胞内的SPINKl抑制时差异表达的基因的qPCR证实。所选择的22RVlsiSPINKl细胞中的a)过度表达基因和b)低表达基因是通过如图所示的定量PCR来进行评价的。图8示出通过多个前列腺癌的图谱研究显示与SPINKl共同表达的基因的鉴定。图9示出前列腺癌的候选物尿基生物标志物的表征。A-C、定量PCR(qPCR)检测来自做穿刺活组织检查或前列腺切除术的患者的尿液的完整转录物组扩增(WTA) cDNA。显示了穿刺活组织检查阴性的 患者或者前列腺癌患者中的生物标志物的表达。图A显示了通过单变量分析(参见表5)对前列腺癌的预测没有明显意义的基因的-ACt值，对预测有明显意义的那些在图B和C中得到显示。D、前列腺癌诊断的单个变量的受试者操作特性(ROC)曲线。图10示出在前列腺癌的检测中一组多元尿液生物标志物优于单个PCA3。A、多变量回归分析产生包括SPINK1、PCA3、G0LPH2和TMPRSS2:ERG的多元化的模型，其对前列腺癌的预测有明显意义(参见表5)。ROC曲线上灵敏度(Sens)和特异性(Spec)的总和最大的点由虚线所表示，同时给出了阳性预测值和阴性预测值(分别是PPV和NPV)。B、和A —样，除了使用留一法交互验证(LOOCV)策略来产生曲线下的非偏倚区。
具体实施例方式当用于Oncomine 数据库时(Rhodes et al., Proc Natl Acad SciUSA101, 9309 [2004] ; Rhodes et al., Neoplasia6, I [2004]),被称为癌症异常谱分析(COPA)的方法正确地鉴定了几种已知的致癌基因，包括白血病中的PBXl和多发性骨髓瘤中的 CCNDl (Tomlins et al.，Science310, 644 [2005])。另外，COPA 指定 ETS 系基因为前列腺癌的候选致癌基因，这促进了 ERG或ETVl和雄激素调控基因TMPRSS2的周期性染色体重排的发现(Tomlins et al., [2005],上文)。因为50-70%的前列腺 癌潜藏TMPRSS2:ETS基因融合，所以进行实验以鉴定另外的前列腺癌的候选致癌基因。所执行的试验将COPA的荟萃分析(meta analysis)用于7个前列腺癌的图谱研究并且分析了在前列腺癌中异常表达的候选物和与ERG和ETVl互斥的过度表达的候选物。作为第2等级的荟萃异常基因的SPINKl在8个数据集中均符合了两个标准。SPINKl在325例前列腺癌的图谱中有50例(15.4%)显示明显的过度表达，而在56例良性前列腺组织样品中仅有I例(1.8%)。在所有325个前列腺癌样品的图谱中，SPINKl、ERG和ETVl显示了互斥的异常表达。通过定量PCR来证实了与良性前列腺组织相比SPINKl在一部分癌症样品中过度表达并且SPINKl、ERG和ETVl互斥的过度表达。来自局部前列腺癌中的一者的组织的过度表达SPINKl的荧光原位杂交法没有揭示基因重排或扩增，这表明SPINKl通过转录增加而被上调。总和这些结果，在不同的分析方式、芯片平台、实验室和样品群组中的一致性表明SPINKl在没有TMPRSS2:ETS基因融合的情况下在前列腺癌中排斥地过度表达(如由ERG或ETVl的过度表达所示)。进一步实验已表明SPINKl异常表达与前列腺癌复发(即，术后)的增加相关联。因此，在一些实施方案中，提供了筛选样品以确定前列腺癌复发的可能性的方法。高复发风险的受试者可能将提供更加积极的治疗方式或其他治疗。相反地，发现复发风险较低或没有高复发风险的受试者可免受不必要的治疗所带来的副作用。定义为更好地理解本发明描述的本发明的内容和权利要求，一些专用术语和短语定义如下:本发明中所用的术语“SPINK1的异常表达”是指相对于已知的正常水平(即，未被诊断为癌症的受试者中的水平)，SPINKl核酸(如mRNA)或蛋白的表达水平变化。在一些实施方案中，正常水平为一个或多个未被诊断为癌症的个体中的平均水平。在其他实施方案中，正常水平是在待诊断的个体中其他组织内确定的。在一些实施方案中，相对于已知的正常表达水平(如非癌组织中的表达水平)，表达变化至少10%、优选至少20%、甚至更优选至少50%、还更优选至少75%、仍更优选至少90%、并且最优选至少100%。可用任何适合的方法来测定表达水平，包括(但不限于)在本发明(如下文的实施例1)描述的那些。在一些实施方案中，SPINKl异常表达呈阳性的样品是那些与正常表达单元的表达差异大于约0.1、优选大于0.2、甚至更优选大于0.5的样品。正常表达单元可使用任何合适的方法来计算，所述方法包括(但不限于)那些下文实验部分描述的方法。本发明中所用的“SPINK1的过度表达”是指相对于已知的正常水平，SPINKl核酸(如mRNA)或蛋白的较高水平的表达。在一些实施方案中，相对于已知的正常表达水平，表达增加至少10%、优选至少20%、甚至更优选至少50%、还更优选至少75%、仍更优选至少90%、并且最优选至少100%。可以使用许多合适的参数来确定已知的正常表达水平。其实例包括(但不限于)非癌性前列腺中的水平(如来自多个未被诊断为前列腺癌的受试者的前列腺组织中的SPINKl表达的平均水平)、非癌性组织中的水平(如来自多个未被诊断为癌的受试者的非前列腺组织中的SPINKl表达的平均水平)、非癌性前列腺细胞系中的水平、或相对的表达水平(如在同一个体中一段时间内的水平)。可用任何适合的方法来测定表达水平，该方法包括(但不限于)那些在本发明描述的那些。在一些实施方案中，表达水平与已知基因的表达水平相当(如表达或相对表达水平)。在一些实施方案中，已知基因为PSA。本发明中所用的术语“与前列腺癌复发相关的基因表达”是指基因表达谱(如SPINKl的异常表达)与对原发肿瘤进行治疗(如手术)后的前列腺癌复发(如在前列腺中或发生转移)相关联。在一些实施方案中，相对于代表性的受试者人群中(例如，缺乏“SPINK1异常表达”的受试者中较大人群(如，一个或多个、优选100个或更多个、甚至更优选1000个或更多个、还更优选10000个或更多个受试者)的平均数)的复发水平，前列腺癌的复发增加至少10%、优选至少20%、甚至更优选至少50%、还更优选至少75%、仍更优选至少90%、并且最优选至少100%。本发明中所用的术语“抗原决定基”指与特定抗体接触的那部分抗原。当蛋白或蛋白片断用于免疫宿主动物时，蛋白的许多区域可诱导产生抗体，该抗体与蛋白的给定区域或三维结构特异地结合；这些区域或结构即指“抗原决定簇”。抗原决定簇可能与完整的抗原(·即用于引起免疫反应的“免疫原”)竞争结合抗体。当参考抗体和蛋白或肽的相互作用而使用术语“特异性结合”或“特异地结合”时是指这种相互作用依赖于蛋白上的特定结构的存在(如抗原决定簇或抗原决定基)；换句话说抗体被识别并结合特定的蛋白结构而不是一般的蛋白。例如，如果抗体对抗原决定基“A”来说是特异性的，在含有标记“A”和抗体的反应中存在含有抗原决定基“A”(或游离的未标记的A)的蛋白将减小与抗体结合的标记“A”的量。当本发明中参考抗体和蛋白或肽的相互作用而使用术语“非特异性结合”和“背景结合”时是指不依赖于特定结构存在的相互作用(即，该抗体与一般的蛋白结合而不是与特定结构(如抗原决定基)结合)。本发明中所用的术语“受试者”是指任何动物(如哺乳动物)，包括(但不限于)人类、非人类的灵长类动物、啮齿动物等，这些受试者是特定治疗的接受者。一般情况下，涉及人类受试者时，“受试者”和“患者”在本发明中是可交换使用的。本发明所用的术语“怀疑患有癌症的受试者”是指存在一个或多个癌症症状指示(如明显的肿块或团块)或正在接受癌症筛选(如在例行体检期间)的受试者。怀疑患有癌症的受试者也可能有一个或多个风险因子。怀疑患有癌症的受试者一般尚未接受癌症检测。但是，“怀疑患有癌症的受试者”包括接受初步诊断(如CT扫描显示团块或PSA水平增加)但癌症的分期还不明确的个体。这一术语还包括曾经患有癌症的人(如处于好转期的个体)。本发明所用的术语“受试者中癌症的表征”是指鉴定受试者体内癌症样品的一个或多个性能，包括(但不限于)良性组织、癌症前期组织或癌性组织的存在、癌症的分期和受试者的预后。癌症可通过鉴定一种或多种癌症标志物基因的表达来表征，所述一种或多种癌症标志物包括(但不限于)在本发明所描述的癌症标志物。本发明所用的术语“受试者中前列腺组织的表征”是指鉴定前列腺组织样品的一个或多个性能(例如，包括(但不限于)癌性组织的存在、可能转化成癌性组织的癌症前期组织的存在、和可能转移的癌性组织的存在)。在一些实施方案中，通过鉴定一种或多种癌症标志物基因的表达来表征组织，所述一种或多种癌症标志物包括(但不限于)在本发明所描述的癌症标志物。本发明所用的术语“癌症标志物基因”是指其单独或与其他基因结合使用时，其表达水平与癌症或癌症预后相关的基因。此相关性可涉及基因表达的增加或减少。例如，基因表达可提不患有癌症，或者基因表达缺乏可与癌症患者的不良预后相关。本发明所用的术语“特异地检测癌症标志物是否存在的试剂”是指用于检测一种或多种癌症标志物(例如，包括(但不限于)在本发明所描述的癌症标志物)的表达的试剂。合适的试剂的实例包括(但不限于)能够与目标基因特异地杂交的核酸探针、能够特异地扩增目标基因的PCR引物、和能够与目标基因所表达的蛋白特异地结合的抗体。在下述的描述和实施例中可发现其他的非限制实例。本发明所用的术语“使用所述试剂盒用于检测所述受试者体内的癌症的说明”包括使用包含在试剂盒内的用于检测并表征取自受试者的样品内的癌症的试剂的说明。在一些实施方案中，使用说 明还包括美国食品和药品管理局(FDA)在标记体外诊断产品方面规定的使用目的的声明。本发明所用的术语“癌症的分期”是指癌症扩散水平的定性或定量评价。用于确定癌症的分期的标准包括(但不限于)肿瘤的尺寸、肿瘤是否已扩散至身体的其他部分、和癌症已扩散的部位(例如，在体内相同器官或相同区域内扩散或扩散至其他器官)。本发明所用的术语“提供预后”是指提供关于癌症的存在(例如，通过在本发明所描述的诊断方法所确定)对受试者未来健康的影响的信息(例如，预期患病或死亡、患癌的可能性和转移的风险)。本发明所用的术语“初步诊断”是指初步癌症诊断的结果(例如是否存在癌性细胞)。初步诊断不包括关于前列腺特异性抗原失效风险的癌症的分期的信息。本发明所用的术语“活组织检查组织”是指当为了确定样品是否包含癌性组织的目的而取自受试者的组织(例如前列腺组织)样品。在一些实施方案中，因怀疑受试者患有癌症，所以获取活组织检查组织。之后，检测活组织检查组织(例如通过显微镜)是否存在癌症。本发明所用的术语“非人类动物”是指所有非人类动物，包括(但不限于)脊椎动物(例如啮齿类)、非人类的灵长类、羊类、牛类、反刍类、兔类、猪类、山羊类、马类、犬科、猫科、
佥米坐坐尚寸寸O术语“基因”是指核酸(例如DNA)序列，所述核酸序列包括产生多肽、前体或RNA(例如rRNA、tRNA)所必需的编码序列。多肽可由全长编码序列或编码序列的任意部分所编码，只要保留全长或片段的所需活性或所需功能特性(例如，酶活性、配体结合性、信号传导性、免疫原性等)。该术语还包括结构基因的编码区和位于邻近该编码区5’和3’端处距离每端约Ikb或以上的序列，以使该基因对应于全长mRNA的长度。位于该编码区的5’端并在mRNA上存在的序列被称为5’非翻译序列。位于该编码区的3’端或下游并在mRNA上存在的序列被称为3’非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被非编码序列(被称为“基因内区”、或“介入区”、或“介入序列”)中断的编码区。基因内区是转录到核RNA (hnRNA)中的基因片段；基因内区可包含调控元件，例如增强子。基因内区是从核转录产物或初级转录产物移除或“剪接”的；因此基因内区不存在于信使RNA (mRNA)转录产物内。mRNA在翻译过程中起作用以在新生多肽内指定氨基酸的序列或次序。本发明所用的术语“异源基因”是指不处于其自然环境内的基因。例如，异源基因包括来自被引入另一个物种中的一个物种的基因。异源基因还包括源于按照一些方式改变(例如，突变、添加多个拷贝、与非天然调控序列连接等)的有机体的基因。因为异源基因序列一般与这样的DNA序列连接，该DNA序列未被发现与染色体的基因序列自然相关或与在自然界内未发现的染色体的部分相关(例如在基因非正常表达的基因座内表达的基因)，所以异源基因不同于内源基 因。本发明所用的术语“基因表达”是指将编入基因内的基因信息通过基因的“转录”(即，通过RNA聚合酶的酶促作用)转换成RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，对于编码蛋白的基因而言，是通过mRNA的“翻译”转换成蛋白的过程。可在该过程中的许多阶段调控基因表达。“上调”或“活化”是指产生增加的基因表达产物(即，RNA或蛋白)的调控，而“下调”或“抑制”是指产生降低的基因表达产物的调控。上调或下调中涉及的分子(例如，转录因子)常常分别被称为“活化因子”和“抑制因子”。除包含基因内区之外，基因的基因组形式还可包括位于在RNA转录产物上出现的序列的5’和3’端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或“侧翼”区域(这些侧翼序列位于在mRNA转录产物上出现的非翻译序列的5’端或3’端)。5’侧翼区域可包含调控序列，例如控制或影响基因的转录的启动子和增强子。3’侧翼区域可包含指导转录终止、转录后裂解和聚腺苷酸化的序列。本发明所用的术语“寡核苷酸”是指长度短的单链多核苷酸链。尽管本发明所用的寡核苷酸的残基长度一般小于200 (例如在15-100之间)，但是该术语还意欲包括较长的多核苷酸链。寡核苷酸常常由其长度所命名。例如，24残基寡核苷酸被称为“24聚体(24-mer)”。寡核苷酸可通过自杂交或通过与其他多聚核苷酸杂交而形成二级和三级结构。此类结构可包括(但不限于)双链体、发夹结构、十字形结构、弯曲结构和三链体。本发明所用的术语“互补的”或“互补”用于指通过碱基配对规则相关的多聚核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“5’-A-G-T-3' ”与序列“3’-T-C-A-5' ”是互补的。互补可以是“局部的”，其中根据碱基配对规则仅有一些核酸的碱基是匹配的。或者，在核酸之间可能有“完全”或“全部”的互补。核酸链之间的互补程度显著影响核酸链之间的杂交的效率和强度。这在扩增反应以及取决于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。术语“同源”是指互补的程度。可能有部分同源或完全同源(即，同一性)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源”的目标核酸杂交的核酸分子。在低严密性条件下，使用杂交分析法(DNA印迹杂交法、或RNA印迹杂交法、溶液杂交法等等)可检测完全互补序列与目标序列杂交的抑制情况。在低严密性条件下，基本上同源的序列或探针将竞争并且抑制完全同源的核酸分子与目标的结合(即，杂交)。但这并不代表低严密性条件为允许非特异性结合的条件；低严密性条件要求两个序列的相互结合是特异性(即，选择性)相互作用。通过利用基本上不互补的(例如同一性小于约30%)的第二目标可检测非特异性结合的缺乏；在非特异性结合缺乏的情况下，探针将不与该第二不互补的目标杂交。当涉及双链核酸序列(例如cDNA或基因组克隆)而使用时，术语“基本上同源的”是指在如上所述低严密性条件下任何可与双链核酸序列中任何单链或双链杂交的探针。当涉及单链核酸序列而使用时，术语“基本上同源的”是指在如上所述低严密性条件下任何可与单链核酸序列杂交(即，它是互补物)的探针。本发明所用的术语“杂交”用来指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸间的缔合强度)受如下因子影响(例如):核酸间的互补程度、所涉及的条件的严密性、所形成的杂种的Tn1、和核酸内的G:C比。在结构内包含互补核酸的配对的单分子被认为是“自杂交的”。本发明所用的术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是指双链核酸分子总体半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的等式是本领域公知的。如由标准参考文献所表示的，当核酸在IMNaCl的水溶液中时，可通过等式:Tm=81.5+0.41 (%G+C)来计算Tm的简单估计值(参见例如，Anderson和Young，定量过滤杂交，核酸杂交[1985])。其他参考文献包括考虑结构特性以及序列特性来计算Tm的更复杂计算。本发明所用的术语“严密性”用来指温度、离子强度和其他例如有机溶剂之类的化合物存在的条件，在该条件下进行核酸杂交。在“低严密性条件下”，目标核酸序列将与其精确互补物、单个碱基失配的序列、密切相关的序列(例如同源性在90%或以上的序列)和仅部分同源的序列(例如，同源性为50-90%的序列)杂交。在“中等严密性条件下”，目标核酸序列将仅与其精确互补物、单个碱基失配的序列和密切相关的序列(例如同源性在90%或以上)杂交。在“高严密性条件下”，目标核酸序列将仅与其精确互补物和(依赖于例如温度之类的条件)单个碱基失配的序列杂交。换句话说，在高严密性条件下，可升高温度以排除与单个碱基失配的序列的杂交。当“高严密性条件”用来指核酸杂交时，其包括等同于下述的条件:当采用长度为约 500 个核苷酸的探针时，在 42°C下在由 5X SSPE (43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 和
1.85g/l EDTA，pH 以 NaOH 调节至 7.4),0.5% 的 SDS、5X 丹哈特试剂(Denhardt，s reagent)和100 μ g/ml的变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交并且接着在包含0.1XSSPEU.0%的SDS的溶液中在42 °C下清洗。当“中等严密性条件”用来指核酸杂交是，其包括等同于下述的条件:当采用长度为约500个核苷酸的探针时，在42°C下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl,6.9g/l NaH2PO4H2O和
1.85g/l EDTA，pH以NaOH调节至7.4),0.5%的SDS、5X丹哈特试剂和100 μ g/ml的变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交并且接 着在包含1.0X SSPEU.0%SDS的溶液中在42°C下清洗。
“低严密性条件”包括等同于下述的条件:当采用长度为约500个核苷酸的探针时，在 42°C下在由 5X SSPE (43.8g/l NaCl,6.9g/1NaH2PO4H2O 和 1.85g/l EDTA，pH 以 NaOH调节至7.4),0.1%的SDS、5X丹哈特试剂[50X丹哈特试剂每500ml包含:5g聚糖体(400型,Pharamcia)、5g BSA (Fraction V ;西格玛(Sigma)]和 100 μ g/ml 的变性鲑鱼精 DNA 组成的溶液中结合或杂交并且接着在包含5X SSPE、0.1%SDS的溶液中在42 °C下清洗。本领域公知可采用许多等同条件以包括低严密性条件；考虑例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)、靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中、被固定等)、以及盐和其他组分的浓度(例如，是否存在甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇)之类的因素，并且可改变杂交溶液以产生不同于、但等效于上述所列条件的低严密性杂交条件。此外，本领域已知在高严密性条件下促进杂交的条件(例如，提高杂交和/或清洗步骤的温度、将甲酰胺用于杂交溶液等等)(参见上述关于“严密性”的定义)。本发明所用的术语“探针”是指寡核苷酸(S卩，核苷酸序列)，其中无论其是在如纯化限制酶切消化中天然存在的的还是合成、重组或通过PCR扩增制备的，其都能够与另一种目标寡核苷酸的至少一部分杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于检测、鉴定和分离特定的基因序列。可考虑用任何“报道分子”标记本发明所用的任何探针，使得在任何检测系统中都是可检测的，所述检测系统包括(但不限于)酶检测系统(例如ELISA以及酶基组织化学分析)、荧光检测系统、放射检测系统和发光检测系统。其意图并非将所描述的方法限制为任何特定的检测系统或标签。当本发明所用的术语“部分”用来指核苷酸序列(如“给定核苷酸序列的一部分”)时，其是指该序列的片段。片段的尺寸范围在四个核苷酸到整个核苷酸序列减去一个核苷酸(10个核苷酸、20个、30个、40个、50个、100个、200个等)。“氨基酸序列”和例如“多肽”或“蛋白”之类的术语并不意味着将氨基酸序列限制为与所述的蛋白分子相关的完整、天然的氨基酸序列。

本发明所用的术语“天然蛋白”是指不包含由载体序列编码的氨基酸残基的蛋白；即，天然蛋白只包含那些天然存在的蛋白中发现的氨基酸。可通过重组方式制备天然蛋白，或者可将天然蛋白与天然存在源相分离。当本发明所用的术语“部分”用来指蛋白(例如“给定蛋白的一部分”)时，其是指该蛋白的片段。片段的尺寸范围在四个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸之间。当术语“过度表达”和语法上的同等术语用来指mRNA的水平时，其是指表示表达水平比在对照或非转基因动物内的给定组织中观察到的表达水平大约高3倍(或更高)。使用若干本领域技术人员已知的技术(包括(但不限于)RNA印迹分析法)中的任一技术来测定mRNA的水平。在RNA印迹法中包括适当的对照以控制来自各接受分析的组织中的RNA的量的差异(例如，28S rRNA的量、以基本上相同的量存在于所有组织内、并存在于每个样品内的丰富的RNA转录产物可用作标准化或规范化在RNA印迹上观察到的mRNA特异性信号的方法)。对存在于尺寸对应于正确拼接的转基因RNA的条带上的mRNA的量进行定量；在转基因mRNA表达的定量时忽略其他少数物种的与转基因探针杂交的RNA。本发明所用的术语“体外”是指人造环境和在人造环境下产生的过程或反应。体外环境可包括(但不限于)试管和细胞培养物。术语“体内”是指自然环境(例如，动物或细胞)和在自然环境下产生的过程或反应。
术语“受试化合物”和“候选化合物”是指任何化学实体、药物、药品等，所有这些都作为用于治疗或防治疾病、病症、不适或身体机能混乱(例如，癌症)的候选物。受试化合物包括已知和潜在的治疗化合物。可通过使用本发明描述的筛选法进行筛选而确定受试化合物是治疗性的。在一些实施方案中，受试化合物包括反义化合物。本发明所用的术语“样品”是以其最广泛的意义使用的。在某种意义上，其意味着包括从任何来源所获得的样品或培养物以及生物样品和环境样品。生物样品可获得自动物(包括人类)并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。然而，不应将此类样品理解为是对适用于所述组合物和方法的限制。本发明所用的术语“前列腺样品”是指任何包含前列腺细胞或分泌物的样品。前列腺样品包括(但不限于)前列腺组织样品(例如活组织检查样品)或尿液样品。本发明所用的术语“检测”可描述进行一般的发现或辨别或者对可检测地标记的组合物进行特异性地观测。本发明所用的术语“siRNA”是指小干扰RNA。在一些实施方案中，siRNA包括约18-25核苷酸长度的双链体或双链区域；并且通常而言siRNA在每条链的3’端包含约2_4个未配对的核苷酸。siRNA的双链体或双链区域中的至少一条链是与目标RNA分子基本上同源或基本上互补的。与目标RNA分子互补的链是“反义链”；与目标RNA分子同源的链是“有义链”，并且其还与siRNA的反义链互补。siRNA还可包含另外的序列；此类序列的非限制实例包括连接序列、或环、以及茎和其他折叠结构。siRNA似乎在无脊椎动物和脊椎动物体内触发RNA干扰和在植物内的转录后基因的沉默过程中触发序列特异性RNA分解中起关键媒介作用。术语“RNA干扰”或“RNAi”是指经由于siRNA基因的表达沉默或降低。这是由siRNA在动物体内或植物内触发的序列特异性、转录后基因的沉默过程，该siRNA在其双链体区域内与沉默基因的序列是同源的。该基因对于有机体而言可以是内源性的或外源性的，存在并整合到染色体中或存在于`未整合到染色体组中的转染载体中。可完全或部分抑制基因的表达。还可认为RNAi抑制目标RNA的功能；该目标RNA可具有完整的功能或部分的功能。本发明描述了用于研究、诊断和治疗癌症的组合物和方法，包括(但不限于)癌症标志物。特别地，本发明提供前列腺癌的SPINKl和其他标志物。因此，本发明提供检测标志物以及药物筛选和治疗应用的方法和试剂盒。1.前列腺癌标志物本发明提供在前列腺癌组织中表达发生特异地改变的标志物。发现该标志物可用于前列腺癌的诊断和表征。例如，本发明所述的试验鉴定SPINKl在前列腺癌中过度表达。此外，SPINKU ERG和ETVl呈现互斥的异常表达。进一步试验鉴定用于检测与前列腺癌相关的基因表达(包括SPINK1、PCA3、G0LPH2和TMPRSS2:ERG融合体)的多重系列检验。A.SPINKlSPINKl (丝氨酸肽酶抑制剂，Kazall型)的cDNA序列在Genbank中的编号为NM_003122.2。由SPINKl编码的肽(又称PSTI或TATI)最初从牛胰腺和人胰液中分离出来；它的常规功能被认为是抑制胰腺中的胰蛋白酶(参见:Haverback etal., Am J Med29, 421-33 (1960) ; Kazal et al.，美国化学会志(Journal of theAmerican Chemical Society) 70，3034-3040 (1948) ;Paju et al., Crit Rev Clin LabSci43, 103-42(2006) ; Greene et al.,Methods Enzymol45, 813-25 (1976))。在许多良性和癌性组织中已检测出SPINKl mRNA和蛋白，然而其在前列腺中的表达并未得到描述(Paju 和 Stenman 的综述,Crit Rev Clin Lab Sci43, 103-42 (2006)，Stenman, ClinChem48, 1206-9(2002) )。SPINKl编码具有79个氨基酸的肽(其具有23个氨基酸的信号肽)，并且其可于健康个体的尿液和血清中检测到(Paju and Stenman,上文)。SPINKl的血清浓度除在重度炎症和胰腺炎中急剧升高外，在很多癌症中可出现调节异常，包括胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、结肠癌、肾癌以及卵巢癌(Paju和Stenman的综述，上文，Stenman,上文)。总之，该项研究使用生物信息学方法在TMPRSS2:ETS阴性前列腺癌亚群中鉴定了显著的SPINKl的过度表达，并用qPCR法确认了这些结果。综上所述，研究结果表明=SPINKl的过度表达在前列腺癌的进展和起到前列腺癌的分子亚型的生物标记的功能中起到重要作用。B.ERG相对于其他正常人体组织，已验证ERG(NM_004449)在前列腺上皮组织中高度表达。ERG基因位于21号染色体上。该基因位于pter基因中的38，675，671-38，955，488碱基对上。ERG基因总计有279，817个碱基对，负链方向。相应的ERG cDNA和蛋白的序列在Genbank中的编号分别为M17254和NP04440(Swiss Protein蛋白序列库的编号为P11308)。C.ETVlETVl基因位于7号染色体上(在Genbank中的编号为NC_000007.11、NC_086703.11 以及 ΝΤ_007819.15)。该基因位于 pter 基因中的 13，708330 - 13，803，555碱基对上。ETVl基因总计有95，225个碱基对，负链方向。相应的ETVl cDNA和蛋白的序列在Genbank中的编号分别为NM_004956和NP_004947 (Swiss Protein蛋白序列库的编号为 P50549)。 D.PCA3PCA3基因也称之为DD3 (参见Bussemakers，PCT公开N0.W098/45420, Schalken, Eur.Urol.34(suppl.3):3 - 6(1998)，Bussemakers etal., Cancer Res.59:5975 - 5979(1999)和 Bussemakers, Eur.Urol.35:408 - 412(1999)),其位于9号染色体上，更准确地说位于9q21_22区域。它包括四个外显子，外显子通过选择性拼接和选择性多聚腺苷酸化来产生不同大小的转录产物。通过RT-PCR法，发现PCA3dd3的表达仅出现在前列腺组织中，而在所有其他测试的组织(包括睾丸、精囊、卵巢、胎盘和膀胱)中都不存在。此外，RNA印迹分析法显示，PCA3dd3在绝大多数检查的前列腺癌中高度表达(50例中占47例)，而在BPH患者或同一患者的正常前列腺细胞中没有表达或极低量表达。相对于正常或BPH组织，前列腺癌中的PCA3dd3至少进行20倍过度表达。PCA3dd3表达似乎随肿瘤级别的增加而增加，而且可在转移病灶中检测到。PCA3为发生明显选择性拼接(以及选择性多聚腺苷酸化)的基因，这通过在RNA印迹上观察到不同大小的转录产物和鉴定不同类型的克隆体中来证实。实质上外显子的各种结合均有可能。 在80个经过分析的cDNA克隆中，由于选择性拼接或选择性多聚腺苷酸化而显示存在至少四种不同的转录产物(例如参见美国专利N0.7，008, 765、PCT 公开 N0.TO05/003387A2、美国专利 N0.7，138，235 和 de Kok et al., CancerRes2002 ;62:2695-8;所述每项专利以引用方式并入于此)。与cDNA克隆相比，基因组克隆的序列分析显示了 PCA3基因的基因组结构。有三个内含子和四个外显子。第一内含子的长度接近20kb。从约5%的cDNA克隆中发现第一 cDNA种属，且该种属含有外显子l、2、3、4a和4b (4b的多聚腺苷酸化后进行了实质 共有的加(polyA)信号)。约15%的cDNA克隆中发现第二 cDNA种属，且该种属中含有外显子l、3、4a、4b和4c,其通过第二外显子(未在该cDNA中出现)的选择性拼接来产生，并以不同的(实质共有的)加(polyA)信号终结。第三cDNA种属含有外显子l、3、4a和4b,且为其是已知种属中最常见的一种(约80个克隆的65%)(见图1)。该cDNA最可能是引起RNA印迹分析法中观察到的最主要的转录产物的原因。所检测的第四类cDNA种属含有外显子1、3和4a，代表约15%的克隆，其在4a后终止，4a是初始DD3克隆的终止点。这里存在的加(polyA)信号接近共有序列。E.G0LPH2G0LPH2(GP73)为与肝癌有关的乙型肝炎的糖蛋白标志物(Block et al.，(2005)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 102，779-784)。GP73为II型高尔基体跨膜蛋白，其在病毒性肝炎患者的肝细胞中高水平地表达(Kladney，et al.，2000, Gene249, 53-65)。GP73在胆管上皮细胞中组成性表达，且在正常的肝细胞中最低限度地表达。相比而言，患有巨细胞肝炎患者的肝脏在多核肝细胞中对GP73表现出强免疫反应活性。GP73mRNA和蛋白在感染病毒(包括腺病毒)后在高度分化的HepG2肝癌细胞中表达。由于GP73为高尔基体跨膜蛋白，因此它被认为不会大量存在于血清、甚至具有损坏的或患病的肝脏的受试者中。已发现在由病毒感染(HBV、HCV)或非病毒感染(酒精导致的肝病、自体免疫性肝炎)导致的肝病中，整个器官中的GP73水平显著增加(Kladney，et al., 2002, Hepatology35 (6):1431-40)。在不考虑病因的情况下，在患病的肝脏中，GP73的肝细胞表达不受调节；而胆管上皮细胞的表达没有明显按变化。Gp73已用做肝癌细胞标志物(参见，US20050112711,该案之全文以引用的方式并入本文中)。F.TMPRSS2:ERG美国
发明者阿鲁·M·钦耐扬, 斯科特·A·汤姆林斯, 丹尼尔·R·罗兹, 罗希特·梅拉 申请人:密歇根大学董事会