专利名称：一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种尖孢镰刀菌的分离方法，尤其是一种从发生百合枯萎病的土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
尖抱键刀菌ifusarium oxysporum Schlechtend Fr.)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起100多种植物维管束萎蔫的病害。该菌也能引起百合的种球基盘腐烂，是百合生产过程中发生最严重的病害之一，全世界百合种植区均有感染和为害的报道。该菌主要危害百合种球基部和鳞片，发病后球根基盘或鳞片上产生褐色坏死或腐烂，造成鳞片散落。从病鳞茎长出的植株明显矮化，叶片发黄或变紫，花茎少而小，严重时整株枯萎死亡。百合贮运过程中病害可持续危害，导致大量鳞茎腐烂，造成严重损失。在我国，百合枯萎病是一种历史性病害，在云南、广州、甘肃等主要百合种植地均有发生危害的报道。近年来由于百合种植面积不断 扩大，加之镰刀菌引起的枯萎病是种传病害，可随种球交易发生大规模传播，百合枯萎病有逐年加重的趋势。随着云南切花百合栽培面积的不断扩大，昆明、玉溪等百合主要种植地枯萎病的发生日趋严重，成为制约切花百合品质提高的重要因素之一。尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物，也可在土壤中生存的兼性寄生真菌。已经发病的土壤，如果继续连作，就会年年发病，轻则减产，重则失收，给花农带来重大的经济损失。要控制该病菌的危害，首先必须分离出病菌，对其生物学特性进行研究，以便建立较好的防治措施。对于尖孢镰刀菌的分离，现有技术大多从发病的植株中，用组织分离法进行分离。如苏世鸣等从西瓜枯萎病发病部位分离出尖孢镰刀菌；梁建根等从辣椒病株根茎处分离出尖孢镰刀菌。但是尖孢镰刀菌引起的枯萎病是一类土传病害，如何从土壤中分离该菌是预防枯萎病的关键技术之一。汪建飞等采集了滁菊连作土壤，并从中分离出尖孢镰刀菌，分离过程中采用的是镰刀菌专性选择培养基，配方较复杂；申卫收等使用了一种非无菌操作的尖孢镰刀菌分离培养基(PEA)进行平板培养计数。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，以便研究并掌握该病菌的生物学特性，最终为根除土壤中的尖孢镰刀菌提供技术支持。本发明通过下列技术方案实现:一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，经过下列各步骤:
1)将受尖孢镰刀菌侵染的土壤研细并过20目筛，按0.01 0.02g 土壤/ml琼胶液的量，在土壤样中加入质量浓度为0.1 0.2%的琼胶液，搅拌均匀后静置至病原菌悬浮；
2)按悬浮液:培养基=0.5 1: 25的体积比，吸取步骤I)的悬浮液置于选择性培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落；所述选择性培养基如下:每升蒸馏水中含有下列组分:磷酸二氢钾KH2PO41.0g
硫酸镁 MgSO4.7H200.5g
蛋白胨5.0g
琼胶20.0g
青霉素30 100 mg
链霉素30 50 mg
利福平50 200mg
五氯硝基苯50 150 mg ；
3)按菌丝体:培养基=0.1 0.2: 25的体积比，从步骤2)菌落中挑取菌丝体移植至新的与步骤2)相同的选择性培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落，如此重复培养2 3次，得到菌落；
4)按菌丝体:培养基=0.1 0.2: 25的体积比，从步骤3)菌落中挑取菌丝体移植至PSA培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养2 4天，得菌落；所述PSA培养基是:每升水中含有马铃薯200g、蔗糖20g、琼胶20g ；
5)在解剖镜下，从步骤4)所得菌落中选择单独的菌丝，并用毛细管从该菌丝顶端插入后，连同培养基一同切下，置于新的与步骤4)相同的PSA培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养3 4天，得尖孢镰刀菌。所述步骤2) 的选择性培养基经过下列方法制备:
用适量氯仿溶解五氯硝基苯至完全溶解；
按IOmg利福平/ml无水乙醇的量，将利福平加入无水乙醇中溶解后,再按0.1 0.3mlNaOH溶液/ml溶解液的量，在溶解液中加入IN的NaOH溶液助溶，直至利福平完全溶解；在每升水中加入下列组分，并搅拌均匀后，进行常规灭菌:
磷酸二氢钾KH2PO41.0g
硫酸镁 MgSO4.7H200.5g
蛋白胨5.0g
琼胶20.0g
利福平50 200mg
五氯硝基苯50 150 mg ；
待温度降至42 45°C后，加入:
青霉素30 100 mg
链霉素30 50 mg
搅拌均匀，得选择性培养基。所述步骤2)的菌落是通过显微镜观察菌丝体生长一致后形成的菌落。本发明所用磷酸二氢钾KH2PO4、硫酸镁MgSO4.7Η20、蛋白胨、利福平、五氯硝基苯为市购分析纯产品；琼胶、青霉素、链霉素为市购产品。本发明所得尖孢镰刀菌的特征是:菌株在PSA培养基平板上生长营养菌丝和气生菌丝，气生菌丝呈白色绒毛状，菌丝上产生小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子，其中，小型分生孢子数量多，形状为卵圆形或椭圆形，大小为(4.3 10.7) μπιΧ (1.4 3.5)μ m ;大型分生孢子呈镰刀形,稍弯曲，大小为(14.2 43.6) μ mX (2.0 4.5) μ m ;厚垣孢子呈球形，直径为8 15 μ m，间生或顶生。本发明具有下列优点和效果:采用上述方案，通过采取选择性培养基来分离尖孢镰刀菌，并通过纯化培养后鉴定尖孢镰刀菌，解决了从土壤中分离鉴定尖孢镰刀菌的问题。为监测土壤中尖孢镰刀菌的数量及土壤消毒效果检测提供了技术支撑。该方法快速、有效，培养基的配方简单。
图1为本发明分离获得的尖孢镰刀菌的分生孢子；
图2为本发明分离获得的尖孢镰刀菌的菌丝；
图3为尖孢镰刀菌大、小型分生孢子的形态特征 图4为尖孢镰刀菌厚垣孢子的形态特征 图5为尖孢镰刀菌菌丝的形态特征图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步说明。实施例1
1、带病土壤样品的准备 选取经常有oxysporum f.sp.危害发病的地块,通过常规的五点取样
法，挖取地下O IOcm深度的土壤，每点取10g，混匀，将混匀的土壤样充分研细，并过20目筛；
2、病菌的分离培养
21、取Ig步骤I所得的土壤样，加入到质量浓度为0.1%的IOOml琼胶液中，搅拌均匀，静置至病原菌悬浮；吸取0.5ml悬浮液放于具有25ml选择性培养基的平板上，并用涂布棒将悬浮液均匀涂满平板；
其中:所述选择性培养基是:每升蒸馏水中含有下列组分:
磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0g/L
硫酸镁(MgSO4.7H20)0.5g/L
蛋白胨5.0g/L
琼胶20.0g/L
青霉素100mg/L
链霉素30mg/L
利福平100mg/L
五氯硝基苯50 mg/L
且经过下列方法制备:
1)用适量氯仿溶解五氯硝基苯至完全溶解；
2)按IOmg利福平/ml无水乙醇的量，将利福平加入无水乙醇中溶解后，再按0.1mlNaOH溶液/ml溶解液的量，在溶解液中加入IN的NaOH溶液助溶，直至利福平完全溶解；
3)在每升蒸馏水中加入下列组分，并搅拌均匀后，进行常规灭菌:
磷酸二氢钾KH2PO41.0g硫酸镁 MgSO4.7H200.5g
蛋白胨5.0g
琼胶20.0g
利福平100mg
五氯硝基苯50mg ；
4)待步骤3)的混合物温度降至42°C后，加入:
青霉素100 mg
链霉素30mg
搅拌均匀，得选择性培养基；
22、将步骤21的平板置于25°C培养，待菌丝长出后置显微镜下镜检，直至菌落生长一
致；
3、病菌的纯化及鉴定
按菌丝体:培养基=0.1 0.2: 25的体积比，从步骤22形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植至新的与步骤21相同的选择性培养基上，于23°C、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落，如此重复培养3次，得到菌落；
4、按菌丝体:培养基=0.1: 25的体积比，从步骤3所得菌落中挑取菌丝体移植至PSA培养基上，于23°C、无光条件下，培养4天，得菌落；所述PSA培养基是:在每升水中加入马铃薯200g、蔗糖20g、琼胶20g，搅拌混合而得；
5、在解剖镜下，从步骤4所得菌落中选择单独的菌丝，并用毛细管从该菌丝顶端插入后，连同培养基一同切下，置于新的与步骤4相同的PSA培养基上，于23°C、无光条件下，培养4天,得尖孢镰刀菌；
挑取步骤5的菌丝在显微镜下镜检，则所得尖孢镰刀菌的特征是:菌株在PSA培养基平板上生长营养菌丝和气生菌丝，气生菌丝呈白色绒毛状，菌丝上产生小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子，其中:小型分生孢子数量多，形状为卵圆形或椭圆形，大小为(4.3 10.7) μ mX (1.4 3.5) μ m ;大型分生孢子呈镰刀形，稍弯曲，大小为(14.2 43.6) μ mX(2.0 4.5) μ m ;厚垣孢子呈球形,直径为8 15 μ m，间生或顶生。实施例2
1、带病土壤样品的准备
选取经常有oxysporum f.sp.危害发病的地块,通过常规的五点取样
法，挖取地下O IOcm深度的土壤，每点取10g，混匀，将混匀的土壤样充分研细，并过20目筛；
2、病菌的分离培养
21、取2g步骤I所得土壤样，加入到质量浓度为0.2%的IOOml琼胶液中，搅拌均匀，静置至病原菌悬浮；吸取0.5ml悬浮液放于具有25ml选择性培养基的平板上，并用涂布棒将悬浮液均匀涂满平板；
其中:所述选择性培养基是:每升蒸馏水中含有下列组分:
磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0g/L
硫酸镁(MgSO4.7H20)0.5g/L
蛋白胨5.0g/L琼胶20.0g/L
青霉素50mg/L
链霉素50 mg/L
利福平200mg/L
五氯硝基苯150 mg/L
且经过下列方法制备:
1)用适量氯仿溶解五氯硝基苯至完全溶解；
2)按IOmg利福平/ml无水乙醇的量，将利福平加入无水乙醇中溶解后，再按0.3mlNaOH溶液/ml溶解液的量，在溶解液中加入IN的NaOH溶液助溶，直至利福平完全溶解； 3)在每升蒸馏水中加入下列组分，并搅拌均匀后，进行常规灭菌:
磷酸二氢钾KH2PO41.0g
硫酸镁 MgSO4.7H200.5g
蛋白胨5.0g
琼胶20.0g
利福平200mg
五氯硝基苯150 mg ；
4)待步骤3)的混合物温度降至45°C后，加入:
青霉素50 mg
链霉素50 mg
搅拌均匀，得选择性培养基；
22、将步骤21的平板置于25°C培养，待菌丝长出后置显微镜下镜检，直至菌落生长一
致；
3、病菌的纯化及鉴定
按菌丝体:培养基=0.2: 25的体积比，从步骤22形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植至新的与步骤21相同的选择性培养基上，于26°C、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落，如此重复培养2次，得到菌落；
4、按菌丝体:培养基=0.2: 25的体积比，从步骤3所得菌落中挑取菌丝体移植至PSA培养基上，于26°C、无光条件下，培养2天，得菌落；所述PSA培养基是:在每升水中加入马铃薯200g、蔗糖20g、琼胶20g搅拌混合而得；
5、在解剖镜下，从步骤4所得菌落中选择单独的菌丝，并用毛细管从该菌丝顶端插入后，连同培养基一同切下，置于新的与步骤4相同的PSA培养基上，于26°C、无光条件下，培养3天,得尖孢镰刀菌；
挑取步骤5的菌丝在显微镜下镜检，则所得尖孢镰刀菌的特征是:菌株在PSA培养基平板上生长营养菌丝和气生菌丝，气生菌丝呈白色绒毛状，菌丝上产生小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子，其中:小型分生孢子数量多，形状为卵圆形或椭圆形，大小为(4.3
10.7) μ mX (1.4 3.5) μ m ;大型分生孢子呈镰刀形，稍弯曲，大小为(14.2 43.6) μ mX(2.0 4.5) μ m ;厚垣孢子呈球形,直径为8 15 μ m，间生或顶生。
权利要求
1.一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，经过下列各步骤: 1)将受尖孢镰刀菌侵染的土壤研细并过20目筛，按0.01 0.02g 土壤/ml琼胶液的量，在土壤样中加入质量浓度为0.1 0.2%的琼胶液，搅拌均匀后静置至病原菌悬浮； 2)按悬浮液:培养基=0.5 1: 25的体积比，吸取步骤I)的悬浮液置于选择性培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落；所述选择性培养基如下:每升蒸馏水中含有下列组分: 磷酸二氢钾KH2PO41.0g 硫酸镁 MgSO4.7H200.5g 蛋白胨5.0g 琼胶20.0g 青霉素30 100 mg 链霉素30 50 mg 利福平50 200mg 五氯硝基苯50 150 mg ； 3)按菌丝体:培养基=0.1 0.2: 25的体积比，从步骤2)菌落中挑取菌丝体移植至新的与步骤2)相同的选 择性培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落，如此重复培养2 3次，得到菌落； 4)按菌丝体:培养基=0.1 0.2: 25的体积比，从步骤3)菌落中挑取菌丝体移植至PSA培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养2 4天，得菌落；所述PSA培养基是:每升水中含有马铃薯200g、蔗糖20g、琼胶20g ； 5)在解剖镜下，从步骤4)所得菌落中选择单独的菌丝，并用毛细管从该菌丝顶端插入后，连同培养基一同切下，置于新的与步骤4)相同的PSA培养基上，于23 26°C、无光条件下，培养3 4天，得尖孢镰刀菌。
全文摘要
本发明提供一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，将受尖孢镰刀菌侵染的土壤研细并过20目筛，加入琼胶液，搅拌后静置至病原菌悬浮；吸取悬浮液置于选择性培养基上，于23～26℃、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落；挑取菌丝体移植至新的选择性培养基上，重复培养2～3次；从菌落中挑取菌丝体移植至PSA培养基上，于23-26℃、无光条件下，培养2～4天；选择单独的菌丝，并用毛细管从该菌丝顶端插入后，连同培养基一同切下，置于新的PSA培养基上，于相同条件下，培养3～4天，得尖孢镰刀菌。为监测土壤中尖孢镰刀菌的数量及土壤消毒效果提供技术支撑。
文档编号C12R1/77GK103074238SQ20131005025
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月8日 优先权日2013年2月8日
发明者张艺萍, 杨秀梅, 瞿素萍, 王祥宁, 王继华, 苏艳, 彭绿春, 张丽芳, 王丽花 申请人:云南省农业科学院花卉研究所