专利名称：热稳定β-葡萄糖苷酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个热稳定￠-葡萄糖苷酶基因及其应用，该基因编码的蛋白可用于降解纤维二糖。
背景技术：
-葡萄糖苷酶又称P -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的P-D-葡萄糖苷键，同时释放出D-葡萄糖和相应的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现此酶。后来的研究发现，￠-葡萄糖苷酶广泛的存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内，它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用(Ramakrishnan Anish, Mohammad Safikur Rahman, and MalaRaoj2007，Application of cellulase from an alkalothermophilic Thermomonosporasp.1n biopolishing of denims，Biotechnol.Bioeng.，96 (I): 48-56.)。随着化石能源危机的日益加剧，以可再生性生物质能源替代化石能源是解决目前能源紧张状况的有效途径(聂恒，朱静，段旭，等，2011，纤维类物质生产乙醇的研究进展，38 (3):28-34.)。木质纤维素是自然界中数量最大的可再生性物质(唐开宇，张全，{冬明友，2009, P -葡萄糖苷酶发酵技术的进展,17 (3):65-70.),木质纤维素能源化利用的关键是纤维素能够高效降解为可发酵性单糖。酶法降解纤维素具有物理化学方法不可比拟的优势一一条件温和、效率高、无抑制后续发酵的有害化学物质产生(SassnerP., Martensson C.G., Galbe M.，et al，2008，Steam pretreatment of H2S04-1mpregnatedsalix for the production of bioethanol, Bioresource Technology，99(I):137-145.)。在纤维素的酶法降解中，需要由包括￠-葡聚糖苷酶、纤维二糖水解酶和￠-葡萄糖苷酶3种水解酶组成的复合酶协同作用(马英辉，王联结，2009，秸杆预处理的最新研究进展，纤维素科学与技术，17 (3):71-78.)，然而在目前所使用的纤维素降解复合酶中，普遍存在3 -葡萄糖苷酶活力低、热稳定性差的缺陷，致使纤维二糖积累，从而抑制了其它2个酶的活性，极大地影响了酶解效率(Garcia-Kirchenr 0., Seguar-GranadosM., Rodriguez-Pascual P., 2005, Effect of media composition and growth conditionson production of旦-glucosidase by Aspergillus niger C~6, Applied Biochemistryand Biotechnology, 121 (1/3):347-359.)。因此对P -葡萄糖苷酶的深入研究受到人们越来越多的关注。除了在降解纤维素方面有着重要作用外，￠-葡萄糖苷酶在其他领域也有广泛应用，特别是在医药、食品、化工、生物转化中具有重要的应用价值(Michael E.H., MarkF.R., Charles E., 1999, Cellulase for commodity products from cellulosicbiomass.Curr.0pin.Biotechnol.，10 (4): 358 364.)。在医学中，￠-葡萄糖苷酶应用在某些癌症的诊断和治疗中，并获得了许多成功(邵金辉，韩金祥，等，2005，￠-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用.生命的化学，5 (01):22-24.)。在果汁生产中，￠-葡萄糖苷酶可以通过水解果汁中的3-D-糖苷键释放出萜烯类物质而增强果汁的香味；同时可以水解花色苷上的糖基去除果汁的颜色(LETRAON-MASSON M.P.，PELLERINP.，1998，Purification and characterization of two旦-D-glucosidases froman AspergiIlusnigerenzyme preparation:affinity and specificity towardglucosylated compounds characteristic of the processing of fruits,EnzymeMicrob.Tech.,22(5):374-382.)。在酿酒中，P _葡萄糖苷酶是重要的酶类物质之一，不仅可以催化产生各类萜烯类物质，而且可以水解各种糖苷类物质生成各种具有芳香气味的苷元，这些物质共同决定了一种酒的特性(Gonzalez-Pombo P., Farinal L., CarraufF., et al, 2011, A novel extracellular旦-glucosidase from Issatchekia terricola:1solation, immobilization and application for aroma enhancement of white Muscatwine, Process Biochem., 46 (I): 385-389.)。许多风味前体物质和药理活性成分主要以糖苷形式存在，需要3 -葡萄糖苷酶这种风味酶将其释放出挥发性糖苷配基，起到增香作用(金凤燮，庄子瑜，鱼红闪，等，2009，特异的中草药配糖体苷酶微生物及其发酵与酶学特性.生物工程学报，25 (12): 1863-1870.)。除此之外，P -葡萄糖苷酶还具有转移葡萄糖基的活性，可用于低聚龙胆糖的生产(Yongling Qin, Yunkai Zhang, Haiyan He, et al,2011, Screening and identification of a fungal旦-glucosidase and the enzymaticsynthesis of gentiooligosaccharide.Appl Biochem Biotechnol.163(8):1012-9.)、红景天苷的酶法合成(王梦亮，李万丽.2009，固定化￠-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究.生物技术，19(1):68-70.)以及非离子表面活性剂烷基糖苷的合成(朱云，2007，葡萄糖酶法生物合成烷基糖苷工艺.浙江化工，38(11):3-6.)。目前已有上百个微生物、植物及动物来源的P-葡萄糖苷酶基因得到克隆并被测序，其中许多微生物来源的3 -葡萄糖苷酶基因已获得异源表达(韩笑，陈介南，王义强，等，2008，￠-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展。生物技术通报，3:8 13.)。相比之下，植物来源的￠-葡萄糖苷酶活性远比微生物来源的￠-葡萄糖苷酶的要低，因此，目前研究主要集中在微生 物来源上(石彩蕊，王义强，陈介南，等，2011，产￠-葡萄糖苷酶微生物育种研究进展，生物技术通讯，3:59 - 65.)。而微生物中研究的较多的是酵母和丝状真菌如木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)等霉菌以及细菌中的芽孢杆菌属等(孟宪文，宋小红，陈历俊，等，2009，￠-葡萄糖苷酶的研究进展.乳品加工，10:42-44.)。但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素以及得到的纤维素酶活力较低，尤其是3-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累而影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。以0 -葡萄糖苷酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现163项发明专利。其中有30项发明专利是描述编码￠-葡萄糖苷酶的基因及其应用，而其他133项是与3 -葡萄糖苷酶在各种领域上的应用有关。在这30项与编码3 -葡萄糖苷酶的基因及其应用相关的发明专利中的P-葡萄糖苷酶基因有8个是来自各种未培养微生物宏基因组文库的、其它22个是来自20种不同生物，有嗜热脱氨芽孢杆菌、里氏木霉、根瘤土壤杆菌、瓶霉XH8、Pyrococcus furiosus、嗜热菌、黑曲霉、端氏木霉、黑曲霉、黑翅土白蚁、Clostridium sp.WGC702、曲霉菌株、嗜热拟青霉、Dictyoglomus thermophilum DSM3960、嗜热毛壳菌、酿酒酵母、极端嗜碱菌、嗜热拟青霉、克氏内芽孢杆菌和新鞘氨醇菌；1个来自白藜芦醇。本发明获得的P -葡萄糖苷酶是来自自行筛选到的链霉菌GX6 (Streptomycessp.GX6)，与基因数据库中公开的P -葡萄糖苷酶的氨基酸的同源性较低，是一个新的葡萄糖苷酶。
发明内容
本发明从广西南宁筛选到的链霉菌GX6的基因组中克隆到一个热稳定P -葡萄糖苷酶基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产3 -葡萄糖苷酶，能以纤维二糖为原料降解生成葡萄糖，并且S-bgl6在50°C保温72小时还保留有75%的酶活力。本发明所述的热稳定P -葡萄糖苷酶基因S_bgl6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。是从实验室构建的链霉菌GX6的基因组中克隆得到。该￠-葡萄糖苷酶基因S-bgl6的序列是由2319个碱基组成，含有完整的P -葡萄糖苷酶基因S-bgl6的开放阅读框(OpenReading Frame, ORF), S_bgl6基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。SEQ ID N0:2的蛋白质是基因S_bgl6编码的￠-葡萄糖苷酶产物S_bgl6，由772个氨基酸组成，和S_ bgl6催化功能域同源性最高的是Streptomyces ambofaciensATCC23877 (生二素链霉菌 ATCC23877)的 putative beta-glucosidase (假定 P -葡萄糖苷酶)两者的一致性=538/750 (72%)，相似性=599/750 (79%)。基因s-bgl6在大肠杆菌中表达的重组产物S_bgl6能够分解纤维二糖。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。本发明所述的热稳定￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6所编码的￠-葡萄糖苷酶在50°C保温72小时还保留75%的酶活力，并且还具有分解纤维二糖的用途。
图1是筛选含有0 -葡萄糖苷酶基因S_bgl6重组菌株的七叶苷选择平板图。图2是P -葡萄糖苷酶S_bgl6纯化物的SDS-PAGE图。图3是P -葡萄糖苷酶S_bgl6水解纤维二糖的HPLC图。从图1 了解到，含有P -葡萄糖苷酶基因S_bgl6的重组菌株能够在七叶苷筛选平板上形成黑色圈。从图2 了解到，P -葡萄糖苷酶S_bgl6纯化物的分子量为82.5kDa。图3中的A和B分别是葡萄糖和纤维二糖的标样。从图3的C 了解到，P -葡萄糖苷酶S_bgl6能将纤维二糖水解成葡萄糖。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括:大肠杆菌(Escherichia coli)株系XLl-blue购自大连TaKaRa公司；表达载体pSE380购自Stratagene公司，限制性内切酶、修饰酶等试剂购自TaKaRa、MBI。下面将通过实施例对本发明作详细描述:I)链霉菌 Streptomyces sp.GX6 基因组 DNA 的提取链霉菌Streptomyces sp.GX6的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA 提取试剂盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目录号 BSC12S1)的使用说明来提取的。
将提取好的链霉菌Str印tomyces sp.GX6的基因组DNA送华大基因公司测定基因组序列。2)链霉菌Streptomyces sp.GX6的基因组序列中编码0 -葡萄糖苷酶基因序列的分析将获得的链霉菌Streptomyces sp.GX6的基因组序列用NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的软件ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和Blast (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析。结果共获得 8 个与 ￠-葡萄糖苷酶具有较高同源性的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF),本发明只涉及其中一个 0RF。3) ￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6的核苷酸序列分析用NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的软件 ORF finder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和Blast (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi) M DNA 序歹Ij 讲-对〒分木斤。基因S-bgl6的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)由2319个核苷酸组成,序列如SEQIDNO:1所示。其中，S-bgl6基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。4) ￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6编码的产物S_bgl6的氨基酸序列分析^ -葡萄糖苷酶基因S_bgl6编码一个含772个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为82494.18道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg.de)分析 3 -葡萄糖苷酶 S_bgl6 的组件结构，结果是自N端的第30-252位和321-539位氨基酸为家族3糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。5) ￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6的克隆和表达使用上游引物5 ’ -CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACACCGCGACCGAAGAAGACGCCG-3，和下游引物5’ -CATAAGCTTTCAGCTCACCTGCCGACCGCTC-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增
葡萄糖苷酶基因S-bgl6，用限制性内切酶Pag I和Hind III酶切￠-葡萄糖苷酶基因S-bgl6后，与经Nco I和Hind III酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物用CaC12法转化到大肠杆菌XLl-blue中，涂布到含100 y g/mL氨苄青霉素的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100 u g/mL氨苄青霉素、七叶苷、柠檬酸铁铵的LA复筛培养基(每IOOmL复筛培养基含:七叶苷:0.2g，柠檬酸铁铵:0.5g，蛋白胨:lg,酵母粉:0.5g，NaCl:
0.5g，琼脂粉:1.5g)平板上，将平板置于37°C恒温箱培养5小时，对每个转点菌落逐个滴加I U L用LB培养基稀释成1%的IPTG诱导表达，然后，将平板置于37°C恒温箱继续培养6小时。时间到后，进行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒温箱使表达的S-bgl6酶与七叶苷和柠檬酸铁铵反应4小时。观察筛选平板。然后进一步提取在筛选平板能形成黑色圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pSE-S-bgl6，用限制性内切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE-S_bgl6后，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-S-bgl6 除有一个约4.5kb的DNA片段外，还有一条大小约为1.9kb的DNA片段。将含有质粒pSE-S_bgl6的重组大肠杆菌XLl-blue菌株接种到600mL含100 U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，待0D_为0.4时，加入IPTG使其终浓度为
0.Smmol /T,, 30°C、220转诱导 10 小时。IIOOOrpm离心 3min,收集菌体，用 4mT, pH7.0lOOmmoI/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min,取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入lmL50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL冲洗缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，250mmol/L 咪唑，pH8.0)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。6) ￠-葡萄糖苷酶S_bgl6水解纤维二糖的测定^ -葡萄糖苷酶S_bgl6以纤维二糖为底物、在pH6.5的磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液和50°C下作用30分钟。反应时间到后，在100°C加热10分钟终止反应。S-bgl6水解纤维二糖的产物用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。HPLC检测的结果显示:S_bgl6能够将纤维二糖水解成葡萄糖。
HPLC条件:仪器:Agilentll00色谱仪；色谱柱:氨基柱;流动相:乙腈:水(70:30);流速:1.0mL/min;检测器:RID (折光检测器)。7) ^ -葡萄糖苷酶S_bgl6热稳定性的测定将纯化的S_bgl6放置在温度为50°C的水浴锅中保温72小时。开始的48小时每隔6个小时取样、后24小时每隔3个小时分别取出IOii L的S-bgl6酶液。然后以对硝基苯基-P -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物在pH6.5和50°C条件下测定S_bgl6的酶活，其中以保存在4°C的S-bgl6在相同条件下测定的酶活作为对照。结果发现P -葡萄糖苷酶S_bgl6在50°C保温72小时后仍然保留有75%的酶活力。
权利要求
1.一个热稳定￠-葡萄糖苷酶基因S-bgl6，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:I所示。
2.根据权利要求1的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
3.—种表达载体,其特征在于,它含有权利要求1所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它是权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求 2所述的蛋白质在降解纤维二糖中的应用。
全文摘要
一个热稳定β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述基因编码的β-葡萄糖苷酶S-bgl6，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，所述基因编码的β-葡萄糖苷酶S-bgl6在50℃保温72小时还保留有75%的酶活力。该酶能够在分解纤维二糖中应用。
文档编号C12N9/42GK103146725SQ20131004960
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者杜丽琴, 韦宇拓, 庞浩, 黄日波, 王子龙, 陆坚 申请人:广西大学