专利名称：一种定向诱导间充质干细胞分化的方法
技术领域：
本发明涉及一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。
背景技术：
在体内或体外特定的诱导条件下，间充质干细胞(MSCs)不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌 肉细胞等中胚层间质组织细胞，还可跨越胚层界限，分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等。所以近年来MSCs成为基础医学和临床医学组织器官损伤修复以及再生领域研究的热点。而实现MSCs向表皮细胞的分化是利用其构建组织工程皮肤的关键步骤之一。MSCs分化的程序是可能存在于其生存的微环境中的指导信号，通过相应的信号转导通路，启动并强化关键基因表达，实现细胞分化。其实质就是MSCs的基因在时空上特异性表达，合成相应的蛋白质，从而细胞在生化、结构和功能方面发生改变，细胞表型随之差异表现。指导转录因子及启动基因表达的信号可能存在于MSCs生存的微环境中，研究表明，微环境中的各种因子表现类型、浓度和应用次序则是影响MSCs分化的重要因素。细胞局部的微环境包括细胞周围多种细胞因子、激素、基质细胞、细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)等，细胞因子的作用尤为重要，不同的细胞因子作用下MSCs可分化为不同的细胞类型。除了可溶性细胞信号分子外，直接的细胞-细胞相互作用对于干细胞的分化也是必要的。Rangappa等利用接触培养和条件培养两种方法培养人骨髓间充质干细胞和心肌细胞后，发现混合培养组用CMFDA标记的骨髓间充质干细胞表达肌球蛋白重链、β-actin和cTnT，而条件培养组只有β-actin表达。体内外实验均显示，MSCs与其他细胞(蒲肯野细胞、心肌细胞和肝细胞等)共培养时有自发的细胞融合，且MSCs在没有诱导剂的情况下分化成其他细胞，提示细胞融合可能是促使MSCs分化的原因之一。MSCs的分化与其生长的微环境有密切关系，因此，体外诱导MSCs分化是通过采取不同的方法模拟体内相应组织细胞生长的真实环境和必要条件。利用目标细胞参与进行共培养诱导的方法往往比较简便易行。直接接触式共培养利用MSCs与其他细胞共培养时有自发的细胞融合，或细胞的自分泌与旁分泌必要的细胞因子，MSCs在没有诱导剂的情况下分化成其他细胞。但这种诱导方法存在两种细胞的分离比较困难的最大缺点，为后续的鉴定或应用带来障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。本发明提供了一种定向诱导间充质干细胞分化的方法，包括如下步骤:将离体的诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。所述目标细胞为非胚胎干细胞。所述诱导细胞可为表皮干细胞，具体可为人表皮干细胞。所述目标细胞可为表皮干细胞，具体可为人表皮干细胞。所述间充质干细胞可为脐带间充质干细胞，具体可为人脐带间充质干细胞。所述聚碳酸酯膜的孔径可为0.2 μ m-2.0 μ m，优选为0.4_1.0 μ m，更加优选为
0.4 μ m $ 1.0 μ m。所述共培养具体可在细胞培养板的培养孔和放置于所述培养孔上的Transwell小室中进行。所述共培养时，所述诱导细胞的培养在细胞培养板的培养孔进行。所述间充质干细胞的培养在Transwell小室中进行。所述聚碳酸酯膜可以阻断细胞通过，所述诱导细胞分泌的诱导因子通过所述聚碳酸酯膜后诱导间充质干细胞定向分化为具有所述诱导细胞属性的目标细胞。所述表皮干细胞表现为表达P63、CK19和β 1-1ntegrin的细胞。P63、CK19和β 1-1ntegrin是三种早期表 皮细胞的标志物，P63经常用来鉴定表皮干细胞，而CK19和β Ι-1ntegrin是表皮干细胞相对特异的标志物。缺乏β l-1ntegrin会显著影响体外角质细胞的分化，而持续表达的β l-1ntegrin对于维持表皮干细胞的特性是重要的。近年来利用Transwell技术通过共培养对间充质干细胞进行非直接接触式共培养诱导分化越来越多的得到应用，通常是将间充质干细胞与诱导细胞分别接种于Transwell上下室之中，通过诱导细胞生长为间充质干细胞创造适宜分化的微环境，通过旁分泌等方式诱导间充质干细胞发生分化以及表型的转变。而间充质干细胞与诱导细胞不直接接触是Transwell技术的特点之一,能够使得诱导后的细胞成分相对单一，避免了分选、纯化或标记等繁琐步骤，为方便诱导后细胞的鉴定及应用奠定基础。本发明中先通过对UCMSCs在不同孔径常用Transwell插件聚碳酸酯膜生长以及迁移情况进行观察，确定0.4 μ m的孔径和1.0 μ m的孔径可以阻断细胞迁移，为进一步采用合适孔径的聚碳酸酯膜正反两面培养细胞提供前期实验准备。根据上述实验结果，本发明建立了预培养目标细胞的新型间接接触式共培养方法，将脐带间充质干细胞与表皮干细胞于聚碳酸酯膜正反两面进行共培养，提供了双层ESCs生长的环境，尤其是膜底面的hESCs能够近距离的提供稳定的局部微环境，并不排除UCMSCs与ESCs通过聚碳酸酯膜微孔有直接接触，扫描电镜发现细胞伪足能够探入微孔，大大提高了诱导效率，而同时，聚碳酸酯膜物理性地隔开了两种细胞。使用这种系统诱导UCMSCs分化并不需要将干细胞与目标细胞进行混合，也不需要特定的诱导液。而这种隔离能够简化鉴定诱导后细胞的步骤。UCMSCs能够在本发明提供的新型的非直接接触式共培养系统内诱导分化为表皮样细胞。本发明为新型非直接接触式共培养在UCMSCs分化为表皮样细胞中的应用提供了实验依据。同样，该共培养系统也可应用于其它类型细胞的分化研究，在基础课题以及临床研究中具有潜在的重要价值。而UCMSCs向表皮细胞的分化在未来能够为临床皮肤再生的研究的进展起到有益作用。本发明为增加MSCs多向分化的诱导方法开拓思路，为进一步采用UCMSCs为种子细胞构建组织工程皮肤提供依据。
图1为实施例1中扫描电镜下UCMSCs在不同孔径聚碳酸酯膜的生长、迁移情况(X1500)。图2为实施例2中的分组处理的流程示意图。图3为实施例2中扫描电镜观察的照片。图4为实施例2中相差显微镜观察的照片。图5为实施例2中免疫荧光检测的结果。图6为实施例2中Western Blotting图谱。图7为实施例2中实时定量PCR检测结果。图8为实施例2中流式细胞术检测结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，应用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析，数据以X ± S表示，采用单因素方差分析比较，以P < 0.01为统计学差异有显著意义。β I整合素(β 1-1ntegrin)、角蛋白19 (CK19)和P63均为表皮干细胞的主要标志物。人表皮干细胞(Epidermal Stem Cells, ESCs):杨亚东，伍津津，朱堂友，毕建军，表皮干细胞的分选鉴定及培养，重庆医学2008年2月第37卷第3期，275-281 ;马英智，王心蕊，何旭，牛云，李玉林，人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定，中国实验诊断学2009年 2 月第 13 卷第 2 期，143-145 ；Zeng Yuan-linl, Xin Guo-hual, Qiu Ze-liang2, In vitroisolation and culture of human epidermal stemCells,中国组织工程研究与临床康复第 12 卷第 43 期 2008 - 10 - 21 出版，8597-8600。人脐带间充质干细胞(UCMSCs，脐带MSCs):侯克东卢世璧张莉袁玫孙明学彭江赵斌眭翔许文静，人脐带Wharton胶中间充质干细胞的分离、培养与鉴定，解放军医学杂志2008年4月第33卷第4期，375-378。Dispease酶:Gibco (美国)。HKGS (人角质化细胞培养因子):Gibco (美国)。Trypsin-EDTA:Gibco (美国)。人胎盘IV型胶原:Sigma (美国)。青霉素_链霉素:PAA (德国)。两性霉素B:PAA (德国)。TE =Gibco (美国)。DTI =Gibco (美国)。Eplife培养基:Gibco (美国)。DMEM 培养基:Gibco (美国)。DMSO:Amresco (美国)。丝裂霉素 C:Roche (美国)。FBS =Gibco (美国)。针对CK19的一抗为兔抗人CK19单克隆抗体:Abcam (美国)。针对P63的一抗为兔抗人P63单克隆抗体:Abcam(美国)。针对β 1-1ntegrin的一抗为鼠抗人β 1-1ntegrin单克隆抗体:Abcam (美国)。FITC标记的羊抗兔IgG:Abcam (美国)。PE标记的羊抗兔IgG:Abcam (美国)。鼠抗人GAPDH单克隆抗体:北京中杉金桥。HRP标记羊抗鼠IgG:北京中杉金桥。HRP标记羊抗兔IgG:北京中杉金桥。间充质干细胞培养基:含100U/ml青霉素、0.lmg/ml链霉素和2.5 μ g/ml两性霉素B的DMEM/F12培养基。表皮干细胞培养基:含100U/ml青霉素、0.lmg/ml链霉素和2.5 μ g/ml两性霉素B的Eplife培养基。
PBS 缓冲液(ρΗ7.4):NaC18.0g、KC10.2g、Na2HPO4L 44g、KH2PO40.24g、蒸馏水定容至 1000ml，用 Na2HPO4 或 KH2PO4 调节 pH 至 7.4。实施例1、脐带间充质干细胞在不同孔径聚碳酸酯膜的生长及迁移一、分组处理1、将脐带间充质干细胞用含10mg/L丝裂霉素C的间充质干细胞培养基处理3h，然后用间充质干细胞培养基洗涤细胞并悬浮细胞。2、分组处理:第一组:将6个TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为
0.4 μ m、厚度为10 μ m)放置于6孔细胞培养板上；第二组:将6个TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为
1.0 μ m、厚度为10 μ m)放置于6孔细胞培养板上；第三组:将6个TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为
3.0 μ m、厚度为10 μ m)放置于6孔细胞培养板上；第四组:将6个TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、孔径为
8.0 μ m、厚度为10 μ m)放置于6孔细胞培养板上。3、将步骤I得到的细胞接种于步骤2得到的细胞培养板上的Transwell小室中，每个小室接种1.5X IO5个细胞，细胞贴壁后，在Transwell小室中加入间充质干细胞培养基，在Transwell小室下的培养孔中加入间充质干细胞培养基，在37°C、5%C02培养箱内培养7天，每天将Transwell小室和培养孔中的培养基更换为新鲜培养基。二、统计细胞迁移率完成步骤一后在相差显微镜下观察、计数迁移至膜底面的细胞数，高倍镜(X400)下视野直径为560 μ m，随机选取6个视野计数。重复实验3次，计算每个视野下平均细胞数。根据视野面积与聚碳酸酯膜面积的比率，计算不同孔径聚碳酸酯膜背面(朝向培养孔的面)上UCMSCs的总数，并根据计算迁移率。
权利要求
1.一种定向诱导干细胞分化的方法，包括如下步骤:将离体的诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述诱导细胞为表皮干细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于:所述诱导细胞为人表皮干细胞。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述目标细胞为表皮干细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于:所述目标细胞为人表皮干细胞。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于:所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述聚碳酸酯膜的孔径为0.2 μ m-2.0 μ m,优选为 0.4-1.0 μ m,更加优选为 0.4 μ m 或 1.0 μ m。
9.如权利要求1至 8中任一所述的方法，其特征在于:所述共培养是在细胞培养板的培养孔和放置于所述培养孔上的Transwell小室中进行的。
全文摘要
本发明公开了一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。本发明提供的定向诱导间充质干细胞分化的方法，包括如下步骤将离体的诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。UCMSCs向表皮细胞的分化在未来能够为临床皮肤再生的研究的进展起到有益作用。本发明为增加MSCs多向分化的诱导方法开拓思路，为进一步采用UCMSCs为种子细胞构建组织工程皮肤提供依据。
文档编号C12N5/074GK103146642SQ20131004941
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者柴家科, 李东杰, 申传安, 孙天骏 申请人:中国人民解放军总医院第一附属医院